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Informe de práctica de laboratorio sobre electroforesis....

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RESUMEN La electroforesis es una técnica utilizada para separar ácidos nucleicos por medio de su tamaño y su carga eléctrica. Se colocan muestras en los pocitos creados en un gel, en este caso el gel de agarosa, luego se someterá a corriente eléctrica y esto realizará la separación del ácido nucleico. En este caso se utilizó un ADN bacteriano, este presenta una carga negativa gracias al grupo fosfato entonces, sus moléculas migrarán hacia el lado positivo. Palabras clave: Ácidos nucleicos, ARN, ADN, Agarosa, Electrodos, marcadores de peso molecular.

INTRODUCCIÓN La electroforesis es utilizada para demostrar la migración de una molécula, ya sea de proteínas o ácidos nucleicos cargada bajo la influencia de un campo eléctrico. Los ácidos nucleicos son de las moléculas más biológicamente importantes, estas poseen unos grupos ionizables que pueden ser cationes o aniones. Estas partes cargadas son las que se van a separar dependiendo de su carga al momento de aplicar un voltaje por medio de los electrodos. La electroforesis de ácidos nucleicos se lleva a cabo en geles de agarosa y es considerada uno de los métodos más sencillos y eficientes para separar fragmentos de ADN, el cual una de sus características es que tienen carga negativa gracias a su grupo fosfato y una vez que es expuesto a un campo eléctrico y en una solución buffer, migrará hacia el lado positivo. Después de realizada la electroforesis los resultados podrán observarse utilizando la fluorescencia. El bromuro de etidio o el SYBR Safe son los colorantes más utilizados ya que se intercalan en la base de los ácidos nucleicos y emiten fluorescencia. el uso de este compuesto debe ser manejado con mucho cuidado y con el cumplimiento riguroso de los protocolos de bioseguridad de los laboratorios debido a que se considera un agente altamente cancerígeno.

METODOLOGIA Para iniciar esta práctica se realizó la preparación del gel de agarosa, mezclando 100 ml de solución TAE (buffer) con 2 g de agarosa (Figura 1) y se llevó al microondas por 150 segundos, esta preparación fue dejada en reposo hasta alcanzar unos 50° c y seguidamente se agregó 10 ml de SYBR safe a la preparación. Al finalizar este proceso la solución anterior se aplicó en la bandeja y allí se depositó el peine para la formación de los posos. Se dejó solidificar durante 30 minutos y se retiró el peine. Ya en la cámara de electroforesis se agregó una cantidad considerable de solución TAE, y se depositó la bandeja con el gel en ella, es importante aclarar que la solución TAE debe cubrir el gel. Ahora es cuando se van a depositar las muestras de ADN, para esto se debe preparar la muestra agregando 5 µl de buffer de carga para completar 15µl de muestra. Figura 2. En los pozos de las esquinas se agregaron 7 µc de marcador de peso molecular Ladder y 15µl de la muestra de ADN se depositaron dejando un pozo por medio. (Figura 3). Se cerró la cámara para conectar los polos eléctricos a una fuente de poder a 100 voltios, el voltaje y amperaje debe ser constante. Durante 45 minutos. Y por último El gel de agarosa se llevó al transiluminador

Figura 1. Frasco Schott con solución de TAE y agarosa.

Figura 2. Vial con 10µl de ADN + 5 µl de buffer de carga.

Figura 3. Muestras depositadas en los pozos del gel de agarosa.

Figura 5. Electroforesis en proceso.

Figura 6. Resultado final de la electroforesis.

DISCUSION DE RESULTADOS En la práctica de laboratorio se realizó la electroforesis de un ADN bacteriano. La electroforesis es una técnica de separación de moléculas en una mezcla por aplicación de un campo eléctrico 1 en gel de agarosa este “es un polisacárido extraído de un alga marina; se disuelve con un amortiguador caliente, se vierte en un molde y se gelatiniza con el simple descenso de temperatura” 2. Como se puede observar en la (figura 3) en el gel de agarosa tenemos 12 pozos de los cuales solo se utilizaron 6, los pozos número 3, 5, 7, 9 que contienen 10µl de ADN bacteriano con 5µl de TAE, “El buffer TAE (tris-acetato-EDTA) es usado principalmente para electroforesis de agarosa debido a que permite una amplia resolución del peso molecular de DNA”3. los pozos de las esquinas contienen 7 µl de marcador de peso molecular (Ladder) que funcionan como un patrón para comparar el resultado de los pares de base de la muestra, “contiene 11 fragmentos de ADN desde 100 a 1,500 pares de bases. Este marcador es ideal para la determinación del tamaño de fragmentos de ADN” 4. Como se puede observar en la (figura 6) las sustancias que se encontraban en los pozos migraron luego de aplicarle fuerza eléctrica, la muestra migra hacia el lado positivo de la cámara debido a los grupos fosfatos que le dan una carga negativa al ADN haciendo que migre hacia el ánodo de la cámara. La concentración de la agarosa es de 2% “La resolución y velocidad de separación de fragmentos de ADN por electroforesis son reguladas a través de la concentración de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis” 5 debido a esto las moléculas con menor tamaño migran con mayor rapidez hacia el polo positivo de la cámara, y al aumentar la concentración de agarosa (poro pequeño)es más difícil el movimiento a través del gel de esta manera se pueden identificar los fragmentos con bajo peso molecular. Y gracias al SYBER safe que sirve como colorante se puede visualizar y comparar con el marcador de peso molecular al colocar en el transluminador. Como se puede observar en la (figura 6) el poso numero 6 contiene ADN con mayor cantidad de pares de bases debido a que a este poso se le aplico mayor cantidad de ADN, sin embargo, todos los pozos contienen la misma cantidad de pares de bases que es de aproximadamente 900 pares de bases, “Cuando se extrae el DNA plasmídico de las bacterias, obtenemos algo que consideramos un producto purificado, pero habitualmente habrá moléculas de plásmido en dos o tres conformaciones, formas topológicamente diferentes. Conocidas como superenrollada, relajada y lineal de longitud completa, corresponden a la misma molécula y tienen todas el mismo número de pares de bases (o “longitud” de la molécula), pero tienen diferente forma, por lo que ocupan un volumen efectivo diferente y avanzan por el gel a distinta velocidad” 6. El ADN

superenrollado viaja más rápido por el gel de agarosa que el ADN relajada y lineal de longitud completa. En la (figura 6) se observan las bandas anchas y difusas esto se debe a la baja cantidad de voltaje que se le aplico y hay poca migración de la muestra de ADN. No se puede realizar la correcta lectura de la electroforesis debido a que el patrón de peso molecular Ladder se ve muy difuso y no se pueden definir la cantidad de pares de bases por consiguiente tampoco se puede hacer en cada una de las muestras de ADN.

CONCLUSIONES

La electroforesis en gel de agarosa es una de las técnicas más adecuadas para la visualización del ADN ya que además de ser de fácil preparación, los colorantes como el SYBR Safe permiten su observación al someterse a luz fluorescente. Una preparación no inadecuada del gel de agarosa hace que la resolución de las bandas obtenidas sea más difícil de observar y analizar. El volumen de ADN y de buffer de carga debe ser exacto (15µl) si esto no ocurre la práctica no podrá realizarse con éxito ya que impedirá una adecuada observación de los resultados finales

BIBLIOGRAFÍA

1. Lodish Harvey, Berk Arnold, Matsudaira Paul, Kaiser Chris, Monty Krieger, Scott Matthew, Zipursky Lawrence, Darnell James.Biologia Celular y Molecular, 5ª edición, editorial médica panamericana,2005. 2. Karp Gerald. Biologia celular y molecular conceptos y experimentos, 7a edición, editorial Mc Graw Hill education, 2002. 3.https://www.velaquin.com.mx/products/buffers-para-electroforesis? variant=37791147777 4. http://www.tnt-lab.com.ar/productos_ladders.htm 5. https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dnasequencing-pcr-electrophoresis/a/gel-electrophoresis 6. http://biomodel.uah.es/an/plasmido/2/1-topo.htm...