Teoría de Electroforesis - Fundamentos teóricos 2021 PDF

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Fundamentos teoricos de electroforesis del curso de química analítica general e instrumental de la universidad nacional de San Luis....

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Técnicas Separativas

ELECTROFORESIS Las electroforesis es una técnica de separación que se basa en migración diferencial (en sentido y velocidad) de partículas cargadas (analitos) en un campo eléctrico establecido al efecto, es decir en un gradiente de potencial. Estas partículas cargadas pueden ser muy variadas: iones simples, complejos, macromoléculas, coloides, o materia corpuscular, bien células vivas como bacterias o hematíes, o materia inerte como arcillas. A pesar de que la más utilizada de las técnicas electroforéticas tiene algunas semejanzas con la cromatografía plana, la electroforesis no puede considerarse como una alternativa cromatográfica. No obstante, muchos libros de textos y monografías sobre esta temática, incluyen capítulos dedicados a las separaciones electroforéticas, llamadas indebidamente por algunos autores "electro cromatografía". También ha recibido otros nombres como ionografía, electro migración, aunque son menos usados. El principal campo de aplicación de la electroforesis es la separación (e identificación y, en su caso, cuantificación) de macromoléculas biológicas, en especial, las proteínas. Aunque puede ser utilizado para diferentes tipos de partículas cargadas que pueden ser muy variadas: iones simples, complejos, macromoléculas, coloides, o materia corpuscular, células vivas como bacterias o hematíes, o materia inerte como arcillas. El químico sueco, Arne Tiselius, investigó por primera vez esta técnica de separación en los años treinta para estudiar las proteínas séricas logrando separar cuatro proteínas claves en el suero (albumina, ,  y  globulina). En 1948 fue galardonado con el Premio Nobel de Química por estos trabajos.

Un sistema electroforético consta de tres partes: (a) Una fase líquida, generalmente constituida por un líquido que contiene electrolitos que facilitan su conductividad eléctrica; en la misma se insertan las especies a separar. En algunos casos se introducen sustancias (por ejemplo, geles), que retrasan el movimiento iónico y que pueden estar en reposo o en movimiento. (b) Una fase sólida (soporte) que se encuentra en contacto (embebida) con la fase líquida. Puede ser un papel, una membrana, un material pulverizado, un gel, etc. Esta fase no existe en la modalidad conocida como electroforesis libre. (c) Una fase gaseosa (atmósfera de la cámara donde se realiza la separación) en equilibrio con la fase líquida. En algunas alternativas no existe esta cámara (ej. electroforesis capilar).

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Antes de iniciarse la separación, es decir, antes de la adición de la muestra, el sistema electroforético debe encontrarse en equilibrio termodinámico, lo que implica que 1. La temperatura sea uniforme, 2. Los potenciales químicos y eléctrico sean los mismos en todo el sistema, y 3. las fuerzas mecánicas estén equilibradas.

Cuando los analitos cargados son introducidos en el sistema, se rompe este equilibrio: además del transporte debido a la atracción electrostática, se producen otros fenómenos dinámicos, como el transporte por difusión al alterarse el potencial químico. El resultado final es un desplazamiento diferencial, según carga, y a diferente velocidad, según las características de las especies cargadas, que provoca la separación, objetivo primordial de la electroforesis.

Modalidades Existen dos formas básicas de electroforesis que se distinguen por la presencia o no de un medio estabilizante en la zona donde se mueven las partículas cargadas: 

Electroforesis libre: es aquella en que el medio de migración es totalmente líquido, de elevada viscosidad a fin de prevenir, en lo posible, los fenómenos de difusión. Tiene un campo de aplicación limitada por las dificultades de mantener una separación nítida entre los componentes de la muestra (ej. Electroforesis capilar).



Electroforesis sobre soporte: la migración de las especies cargadas se puede realizar a través de un medio estabilizante que está impregnado de la disolución electrolítica que contiene a la muestra. Este medio estabilizante puede estar en forma plana (papel de filtro, una membrana, capa fina), o bien una columna conteniendo material pulverizado poco compacto o gel homogéneo o con gradiente de porosidad, soporte sólido, etc.) que dificultan el movimiento iónico libre. Dependiendo del soporte que se utilice se pueden separar hasta 25 fracciones proteicas de suero humano; en el caso de emplearse acetato de celulosa, se obtienen 5 fracciones: albuminas, 1--globulina, 2globulina, globulina y globulina.

Fenómenos de transporte de disolución. En el sistema electroforético pueden originarse diversos fenómenos que se traducen en un transporte de materia: difusión, migración, convección y flujo calorífico que afectan de manera decisiva a la separación electroforética.

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La Migración se define por migración al movimiento de las especies producida por una fuerza externa que es impuesta al medio, en este caso, el campo eléctrico y su intensidad. Algunos autores la denominan electrodifusón. Cuando se impone un potencial eléctrico a través de una disolución, el movimiento de una especie cargada vendrá definido por la denominada movilidad iónica, , que es un factor de proporcionalidad entre la velocidad de desplazamiento, v, y el campo eléctrico aplicado (el campo eléctrico es una función del gradiente de voltaje aplicado entre los electrodos).

Fundamentos teóricos Si se considera una partícula cargada de geometría esférica sometida a la acción de un campo eléctrico, se puede establecer el valor de la resistencia a desplazarse en un medio, siguiendo la ley de Stokes que postula que: “toda partícula que se mueve a través de un medio de viscosidad  con velocidad, v, relativamente pequeña, experimenta una fuerza contraria al movimiento, o fuerza de resistencia, debida a la viscosidad del fluido.”. Luego la fuerza resistiva es: Fr = 6  r v

Ec 1

Donde viscosidad del medio r: radio de la partícula v: velocidad con que se mueve la partícula La fuerza impulsora o fuerza con que es atraída la partícula cargado bajo la acción del campo eléctrico es : Fe = H.q

Ec 2

Donde H: intensidad de campo eléctrico q: carga de la partícula Cuando se igualan ambas fuerzas, la partícula adquiere movimiento uniforme Fr = Fe

Ec 3

6 r v = q.H

Ec 4

De aquí podemos despejar la velocidad de migración, v, con que se mueve la partícula hacia el ánodo o cátodo durante la electroforesis, la cual depende de la molécula y del campo eléctrico aplicado. v = H.q / 6 r

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y definir la movilidad como la velocidad de migración por unidad de campo eléctrico:

μ=

v q  H 6πrη

Ec 6

A partir de esta ecuación es evidente que la movilidad es mayor al aumentar la carga y al disminuir el radio iónico. La relación con la viscosidad de la disolución es también inversa. Cuando se impone el potencial eléctrico a través de una disolución, el movimiento de una especie cargada vendrá definido por la denominada movilidad iónica, , que es un factor de proporcionalidad entre la velocidad de desplazamiento, v, y el campo eléctrico aplicado (el campo eléctrico es una función del gradiente de voltaje aplicado entre los electrodos).

La movilidad, µ (cm2 V-1 s-1) es pues la relación entre la velocidad del ión, v (cm.s-1), y la intensidad del campo eléctrico o el gradiente de voltaje E/L impuesto (E=voltaje o diferencia de potencial; L=longitud del soporte - cm).

Ec 7 Como el ión avanza una distancia d en un tiempo t, sustituyendo la velocidad v por su equivalente d/t, se obtiene una expresión que relaciona el tramo recorrido, d, por el analito con la movilidad (µ) , el potencial aplicado (E), longitud de soporte electroforético (l) y tiempo (t): Ec 8

Ec 9 La separación de dos partículas será posible solo en aquellos casos en que las movilidades que presenten dichas partículas sean suficientemente distintas. Así pues, la separación electroforética está relacionada directamente con: a. La diferencia en movilidad iónica (carga y radio iónico), b. El gradiente de potencial y c. El tiempo que dura la aplicación del potencial.

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ELECTROFORESIS SOBRE SOPORTE Factores que influyen en la migración electroforética Existe una serie de factores esenciales que afectan a la velocidad de desplazamiento de las especies químicas durante la separación electroforética. Pueden distinguirse dos grupos: factores inherentes a las partículas y factores inherentes al medio.

Factores inherentes a las partículas a) Carga, signo y radio iónico: de las ecuaciones matemáticas enunciadas se deduce que cuanto mayor sea la carga de la partícula, mayor será su movilidad; además, su carácter catiónico o aniónico determinará la dirección de desplazamiento. El radio iónico es también representa un factor decisivo: a igualdad de cargas, cuanto menor radio posea el ión, mayor será su movilidad. Estos factores están menos diferenciados en las proteínas, ya que pueden tener muchas cargas y sus pesos moleculares son muy elevados y diversos. En este caso se utiliza la relación carga/masa para predecir la movilidad iónica. b) Anfoterismo: cuando se trabaja con electrolitos débiles que presentan comportamiento ácido – base, las modificaciones de pH de corrida electroforética, favorecerá o reprimirá la disociación. En el primer caso, la especie estará como ion y difundirá hacia el electrodo con signo de carga opuesta. Por el contario, si la disociación se reprime completamente, la molécula indisociada y carente de carga, no experimentará desplazamiento alguno debido a la fuerza ejercida por la acción del campo eléctrico. Basado en esta propiedad es que se determinan en la práctica los puntos isoeléctricos de los aminoácidos. El punto isoeléctrico, llamado PI, es el valor de pH para el cual el aminoácido en cuestión carece de carga neta (contiene igual número de cargas positivas y negativas).

El valor del PI, se determina observando la migración durante la electroforesis en una serie de soluciones reguladoras de diferentes pH. En la separación de aminoácidos, el pH es de suma importancia en la separación electroforética. En el denominado punto isoeléctrico, pH = pKa, el aminoácido está como "zwitterion", sin carga neta, por lo que carece de movilidad iónica. Cuando el pH < pK1, existe como catión y se desplazará hacia el electrodo negativo o cátodo. A pH > pK2, existirá como anión y se desplazará hacia el electrodo positivo o ánodo.

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Figura 1: Anfoterismo

La influencia tan marcada del pH permite la separación electroforética de una mezcla compleja de aminoácidos. Por ejemplo, si se considera la separación de dos de ellos: el ácido glutámico e histidina. Los puntos PI respectivos son muy distintos (7,7 y 3,3). Una corrida electroforética llevada a cabo empleando un buffer de corrida de pH 3,4 la histidina estará completamente protonada y se desplazará hacia el cátodo; el ácido glutámico a ese valor de pH próximo a su PI, se encontrará parcialmente disociado y por ello, se moverá sólo lentamente en dirección opuesta hacia el ánodo. Si ahora la electroforesis se realizara a pH 7,2, próximo al PI de la histidina, ésta se mueverá muy lentamente hacia el cátodo, mientras que el ácido glutámico se encontrará en forma totalmente aniónica y se dirigirá a mayor velocidad hacia el ánodo.

Factores inherentes al medio a) Voltaje y tiempo: a > E y a > t, la partícula recorre una distancia mayor,

Se puede trabajar con bajo voltaje (0 -500V) o a voltaje elevado (500 – 1500 V). El primer modo de operación es el más usado y presenta escasas complicaciones. Si bien a alto voltaje se producen separaciones más rápidas, el calor generado por efecto joule puede llegar a dañar el soporte.

b) Fuerza ionica ( µi):

μ

q 1 6 π r η 1  rA  i

Ec 10



Teniendo en cuenta la Ec. 10 se infiere que en la corrida electroforética la fuerza iónica (µi) debe ser mantenida lo más baja posible. Sin embargo, puede suceder que los frentes electroforéticos obtenidos en esta condición resulten pocos nítidos. Por otro lado, un aumento de este parámetro experimental aumentará la conductividad del medio migrante; como consecuencia de esto, se elevara la intensidad de corriente y por efecto Joule

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producirá un aumento de temperatura del medio, pudiendo deteriorar el soporte por quemado y/o desnaturalizar las proteínas. Por lo antedicho, este parámetro debe ser controlado a los fines de obtener separaciones eficientes sin producir daños en la muestra.

c) Flujo electroendosmótico: como consecuencia de fenómenos superficiales de contacto, el soporte en contacto con el buffer de corrida, adquiere carga eléctrica. Generalmente se carga negativamente, pero puede cargarse positivamente o no hacerlo, lo cual depende del tipo de soporte, de los iones y de la fuerza iónica. Como el soporte es una estructura rígida que no puede migrar, pero si puede hacerlo la solución del buffer de corrida en la que se encuentra embebido el soporte, generando una circulación de la solución hacia el cátodo, denominado Flujo Electroendosmótico (Fo, FEO o sus siglas en inglés EOF). La magnitud del Fo depende del potencial aplicado (a > E, > Fo), del buffer empleado en la corrida y del soporte. Es decir, si aplicamos una diferencia de potencial a los extremos del soporte, existe un flujo de liquido hacia el electrodo de carga opuesta a la solución, el que denominamos Flujo electroendosmótico (Fo).

Figura 2: Flujo electroendosmótico

d) Temperatura. Flujo Hidrodinámico: el pasaje de corriente eléctrica a través de un electrolito por efecto Joule genera calor. Como consecuencia se produce evaporación del solvente en el medio migrante, resultando máxima en el centro y mínima en los extremos del soporte. Esta evaporación produce un gradiente de concentración que provoca la succión, por parte del soporte del buffer, desde los compartimentos electródicos hacia el centro del mismo, este flujo se denomina Flujo Hidrodinámico (Fh) que es máximo en los extremos y 0 en el centro. Si el Fh es elevado puede producir frentes electroforéticos difusos. Se concluye que existen fundamentalmente 3 tipos de fuerzas que actúan sobre las partículas en un campo electroforético:

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Técnicas Separativas 1. Campo eléctrico, H. 2. Flujo electroendosmótico, Fo. 3. Flujo hidrodinámico, Fh.

Una partícula cargada negativamente sembrada en una tira electroforética y sometida a la acción del campo eléctrico actuarán las siguientes fuerzas: -Desde el punto de siembra hasta el centro de la tira, el Fh actuará a favor de la movilidad electroforética (hacia el ánodo) y el Fo en contra. - Sobrepasado el centro del sopote, la partícula encuentra cada vez mayor resistencia cuando se aproxima al ánodo (izquierda).

Figura 3: Fuerzas que actúan sobre las partículas móviles en un campo electroforético

e) Desniveles entre las cubas: Si la solución reguladora en los dos compartimentos de la cuba no se encuentra nivelada, por el principio de los vasos comunicantes, se producirá un flujo grosero de líquido desde el compartimento de mayor nivel al de menor, lo que provocará una difusión excesiva en los frentes. f) Viscosidad del medio: si la viscosidad del medio electroforético aumenta, la movilidad de la partícula (µ) disminuye, pero con el beneficio de que la difusión resulta mínima.

g) Tortuosidad del camino

En electroforesis sobre soporte, si se considera esta ecuación, los resultados serán inexactos porque esa distancia (d) no es la que recorre realmente la partícula. Las partículas,

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Técnicas Separativas por ejemplo en soporte de papel, sigue una trayectoria tortuosa, entre los intersticios que dejan las fibras de celulosa inmóviles, y en consecuencia su recorrido real, (d´), será mayor que el aparente.

Figura 4: Camino recorrido por las partículas

h) Reacciones de Electrodos Los procesos que ocurren en los electrodos, son relativamente independiente de los que ocurren en el soporte. Estos procesos son: En el cátodo se produce la descarga de H2 y la formación de HO-, por lo tanto existe una alcalinización. 2H2O 

2 HO- + H2

En el ánodo se produce la formación de O2 y H+, por lo tanto existe una acidificación. 2 HO- 

2H+ + O2

Como consecuencia de estos fenómenos resulta necesaria la utilización de soluciones reguladoras para mantener el constante el pH en la cuba durante la totalidad de la corrida electroforética. Es conveniente también, el uso de dispositivos laberinticos en los compartimentos electródicos para que los productos que se forman cerca de los electrodos tarden suficiente tiempo en llegar al soporte y no pongan en peligro el poder regulador del buffer. Lo que se intenta es mantener los electrodos generalmente de platino o de carbón, en recipientes con un volumen amplio de electrolito, en lugar de ponerlos directamente en contacto con la zona de separación electroforética. En algunos casos se usan membranas semipermeables para evitar una entrada de estos productos redox en el sistema de separación. Se puede usar también la solución reguladora varias veces sin riesgo, cambiando la polaridad de los electrodos entre una corrida y otra, así las reacciones que se producen en un sentido, luego lo hacen en otro, produciendo de este modo su neutralización. Se puede usar también la solución reguladora varias veces sin riesgo, cambiando la polaridad de los electrodos entre una corrida y otra, así las reacciones que se producen en un sentido, luego lo hacen en otro. Dr. César Almeida

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i) Fenómenos de difusión La difusión se produce por la existencia de gradientes de concentración que favorecen el transporte de una especie desde zonas de mayor concentración hacia zonas de menor concentración. Los fenómenos de difusión se deben evitar siempre que sea posible. La difusión depende:  Tamaño de la partícula: a mayor tamaño, menor difusión.  Tipo de soporte: el soporte aumenta la viscosidad del medio migratorio por tanto, a mayor viscosidad del soporte, menor difusión.  Temperatura: a mayor temperatura, mayor difusión.  Concentración de la sustancia separar.  Tiempo de corrida electroforética: a mayor tiempo, mayor difusión.

lo

Instrumentación Un instrumento para electroforesis destinado a efectuar la separación y el estudio del comportamiento de los componentes de mezclas electroforéticamente activas están constituidos por dos elementos fundamentales: 1.- La fuente de poder que suministra energía eléctrica (diferencia de potencial, voltaje, V) para el desplazamiento y subsiguiente separación de las distintas fracciones de las mezclas. 2.- Cubas o celdas electroforéticas de separación, diseñadas en distintas formas y tamaños, que poseen electrodos (generalmente de platino o de carbón) a los que se les aplica la diferencia de potencial. Se han realizado muchas modificaciones a los instrumentos de electroforesis, y las posibilidades de variación de los distintos tipos de celdas son prácticamente ilimitadas, celdas sin cámara de vapor y celdas con cámara de vapor. En la Fig. 5 se muestra un esquema de una cuba electroforética.

Papel

Buffer

Figura 5: Cuba electroforética

D...