Tema 4. Electroforesis PDF

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Tema 4: Electroforesis La electroforesis es una técnica que permite separar las moléculas cuando están sometidas a un campo eléctrico, por lo que solo se podrá utilizar con aquellas moléculas que posean carga, es decir, proteínas y DNA. Al contrario que la cromatografía, la electroforesis es una técnica eminentemente analítica (determinación de pesos moleculares, pureza…), aunque en algunos casos puede ser también preparativa. Las moléculas se moverán hacia un polo u otro del campo eléctrico, en función de su carga (lo hacen hacia el polo de carga opuesta). Como resultado, se obtiene una banda de cierto grosor, debido a la difusión de las moléculas (cuanto mayor sea el grosor, menor será la resolución de la técnica). Se define como movilidad electroforética (U) la distancia que recorre una molécula en un campo eléctrico. Esta magnitud es difícil de evaluar, ya que depende de varios factores: campo eléctrico (diferencia de potencial, intensidad, resistencia), densidad de carga de la molécula (relación entre la carga y la masa), tampón (fuerza iónica, pH, presencia de agentes desnaturalizantes) y tipo de soporte (si es restrictivo influirá en la movilidad de la molécula, según su forma, tamaño y carga). Por ello, se utiliza más el concepto de movilidad electroforética relativa (Ur): el cociente ente la Rf de la molécula problema y la de la molécula patrón. Esta Rf representa la distancia que recorre una molécula en relación al frente de iones de la electroforesis.

Electroforesis zonal Este tipo de electroforesis se realiza sobre un soporte sólido.

Soportes 



Geles de agarosa (almidón): se trata de un gel horizontal, ya que debe estar sumergido en tampón porque es sensible a la temperatura. Este tipo de soporte es restrictivo para DNA y no restrictivo para proteínas (la agarosa forma poros muy grandes por lo que no se separan correctamente las proteínas). Geles de poliacrilamida (PAGE): el soporte es vertical, ya que es más resistente a la temperatura. Los PAGE son restrictivos tanto para DNA como para proteínas.

Geles de agarosa: DNA Para construir el gel, se calienta la disolución de agarosa, para que esta polimerice, y, posteriormente, se enfría para que se solidifique. Este soporte no debe cargarse al hacer pasar el campo eléctrico, para que no interacciones con el DNA. Si la agarosa que se utiliza no es del todo pura, al polimerizar puede quedar unida a contaminantes (como sales), que sí pueden tener carga; este fenómeno se conoce como electroendosmosis. Las características del gel de agarosa son: inerte, trasparente, resistencia relativa a pH y T (aunque poca a esta última), resistencia a agentes desnaturalizantes, variedad en el tamaño del poro según la concentración de agarosa (cuanto mayor sea la concentración, menores serán los poros). Visualización Para visualizar las moléculas separadas, pueden utilizarse diversos métodos:   

Tinción: bromuro de etidio u otros colorantes (SYBR). Hibridación: identificación por secuencia (northern y southern) Marcaje radiactivo: se marcan previamente las moléculas y se revelan en un film fotográfico.

El criterio de separación de la electroforesis no es la carga ni el tamaño, sino la combinación de ambas: la densidad de carga. Sin embargo, todos los fragmentos de DNA tienen la misma densidad de carga (una molécula de 10 pb tiene 20 cargas, una de 100 pb tiene 200 cargas…). Su separación se debe a que el soporte de agarosa es restrictivo, por lo que se separarán los fragmentos en función del tamaño. Aplicaciones El cálculo de pesos moleculares se realiza a través de una recta patrón del log de la masa sobre el Rf. Se utiliza la Rf de la molécula problema para extrapolar su masa a través de la recta. La electroforesis también puede utilizarse para separar fragmentos lineales de DNA por tamaño:   

Mapas de restricción: determinar la masa de los fragmentos resultantes de una digestión para identificar los lugares de corte de los enzimas de restricción. Determinar el tamaño de un fragmento amplificado por PCR. Recuperación de DNA de geles de electroforesis. o Electroelución: se corta el fragmento de gel que contiene el DNA de interés y se coloca en un saco de diálisis dentro de una disolución. Se hace pasar una corriente, de forma que el DNA se mueve hacia el polo positivo y se engancha a la pared del saco. Después, se cambia durante

un momento la polaridad del campo, de forma que el DNA se desengancha (se mueve hacia el polo opuesto). o Agarosas especiales: se funden a baja temperatura y posteriormente se purifica el DNA. Los DNA circulares no se separan por su tamaño, sino por su forma: la relajada ocupa más espacio y se mueve más despacio y la supercoiled ocupa menos y lo hace más rápido (si el DNA es de calidad, esta banda debe ser más gruesa). En relación a esto se utiliza el concepto de topoisomeros: la misma molécula de DNA más o menos enrollado debido a la acción de topoisomerasas. Electroforesis de campo pulsante Es una técnica que se utiliza para separar moléculas de DNA de gran tamaño. El DNA se mueve de forma paralela al campo eléctrico: es decir se colocan en vertical (en el mismo eje del campo) para moverse. Las moléculas grandes, una vez orientadas, se mueven prácticamente a la misma velocidad, pero la velocidad de orientación sí es diferente. Por tanto, en este tipo de electroforesis, se va cambiando continuamente la dirección del campo, por lo que las moléculas sí acaban separándose en función de su tamaño.

Geles de poliacrilamida (PAGE) El soporte está formado por polímeros de acrilamida unidos entre ellos por moléculas de bisacrilamida (para lo que se necesita persulfato). Como resultado, se forma una red de mayor o menor densidad en función de la concentración de las dos moléculas. Las características de este soporte son: inerte, transparente, estable, resistente a agentes desnaturalizantes, no hay efecto electroendosmótico y hay una gran variedad en el tamaño del reticulado. En este caso, el gel no está sumergido en el tampón, sino que hay dos cubetas separadas por el gel: la corriente va desde una de las cubetas hacia la otra a través del gel. La muestra se aplica en un tampón denso (con glicerol) y se utiliza un marcador electroforético (molécula pequeña y muy cargada, que viaja en vanguardia) que permite comprobar el estado de la electroforesis. Electroforesis de DNA nativos Permiten detectar y determinar el peso molecular de fragmentos pequeños. Por otro lado, también se utilizan para detectar interacciones DNA-proteína: se mezcla el fragmento de DNA con un extracto de proteínas; si en este extracto existe la proteína que interacciona con ese fragmento, se obtendrán proteínas sueltas, DNA suelto y DNA

interaccionando con proteína. Las primeras serán las más lentas (menor densidad de carga), el segundo el más rápido y el complejo DNA-proteína tendrá una velocidad intermedia. Al teñir para visualizar, solo se verán dos bandas, ya que no se utiliza un colorante para la proteína. Este tipo de geles denomina geles de retardo o band-shift. El super shift consiste en añadir a la electroforesis anticuerpos específicos para el FT que se está utilizando, de forma que la banda se marcará si se ha unido al DNA el FT de interés y no otro.

Electroforesis de DNA desnaturalizados Secuenciación del DNA mediante el método de Sanger

Durante la PCR se añaden los nucleótidos normales y un dideoxido: a medida que polimerizan, las cadenas pueden incorporar la base normal o el dideoxido (que bloquea la polimerización al no poder formarse el enlace fosfodiéster), por lo que al final se obtienen cadenas de diferentes tamaños. Este método se aplica para todos los tipos de nucleótidos y se recuperan las monocadenas con el primer marcado. Finalmente, se realiza la electroforesis, de forma que se puede determinar la secuencia. Actualmente, este proceso se hace de forma automática, marcando con diferentes fluorocromos cada dideoxido e introduciéndolos todos juntos en la PCR. A continuación, se realiza una electroforesis y se hace pasar por un fluorómetro que detecta el color y realiza una gráfica que permite determinar la secuencia.

Footprinting (interacciones DNA-proteína)

Permite determinar exactamente los nucleótidos que reconoce una proteína (no solo si hay interacción o no, como en el bandshift). El DNA se marca en un extremo y se pone en contacto con la proteína. Posteriormente, se trata con DNasa1, que corta el DNA de forma inespecífica (pero no puede hacerlo allá donde esté unida la proteína). Si el DNA no estuviese unido a proteína se producirían fragmentos de todos los tamaños posibles; pero cuando se une la proteína, no se generan los fragmentos que corresponderían al corte en esos nucleótidos en los que se une. Si se realiza una electroforesis de ambas muestras puede verse un hueco correspondiente a este lugar en que se une la proteína. Electroforesis de proteínas Para la visualización se usan métodos diferentes a los del DNA:    

Tinción: Coomasie Blue, nitrato de plata, colorantes fluorescentes. Actividad enzimática. Marcaje radiactivo. Detección inmunológica (western).

PAGE nativo

El criterio de separación es la densidad de carga y se realiza cuando interesa conservar la estructura, la carga o la actividad de la proteína. Un ejemplo sería la separación diferentes isoformas de un enzima que se diferencian por ciertos aminoácidos, es decir, por su carga. Tienen la ventaja de que, como la proteína sigue siendo nativa, pueden revelarse por actividad: se añade un sustrato que, al transformarse en producto, precipita. Como las proteínas corren por densidad de carga, los PAGE nativos no permite determinar el peso molecular. PAGE desnaturalizantes

El desnaturalizante más utilizado es la urea. Se usa para: 



Histonas: ya que no corren bien en geles de SDS, porque este no apantalla bien las cargas de las lisinas, que abundan en las histonas. En este caso, como la proteína tiene carga positiva, se moverá hacia el polo negativo del campo eléctrico, al contrario que los ejemplos anteriores. Determinar la estabilidad proteica (resistencia a desnaturalizarse). Hay un solo pozo, por lo que solo se puede analizar una proteína. El gel se realiza con un gradiente creciente de urea en sentido perpendicular al de la corriente. Al ir avanzando, la proteína avanzará más por un lado del gel que por el otro (ya que

donde la concentración de urea es mayor, se desnaturaliza y va más lenta). Por tanto, el criterio de separación es la forma, ya que la proteína es la misma (misma carga y tamaño).

Electroforesis de poliacrilamida y detergentes iónicos (PAGE-SDS)

Permite determinar de forma muy precisa el peso molecular de las proteínas, por lo que el sistema debe igualar la forma y la densidad de carga de las diferentes proteínas, para que se separen únicamente por su tamaño. La igualdad de forma se consigue mediante el agente desnaturalizante, el SDS, que hace que las proteínas pierdan su estructura secundaria (rompe los puentes de hidrógeno). El SDS también permite igualar las cargas: la parte hidrofóbica (cadena carbonada) del SDS interacciona con las cadenas laterales de los aminoácidos y expone la parte cargada negativamente hacia afuera; de esta forma se anula la carga de los aminoácidos y todas las proteínas quedan cargadas con más o menos cargas negativas en función de su tamaño, es decir, todas tienen la misma densidad de carga (como el DNA).

Electroforesis de proteínas PAGE-SDS con agentes reductores

En este tipo de PAGE se usan agentes reductores, que rompen enlaces covalentes, como los puentes disulfuro. Por tanto, permite dar información sobre si hay estos puentes o si la proteína tiene varias subunidades unidas por ellos. Se suelen utilizar combinados con PAGE-SDS normales: si la proteína no presenta S-S entre subunidades, la banda de la electroforesis convencional es igual a la de la que incorpora agentes reductores; si hay puentes, en la normal no se romperán y las dos subunidades correrán juntas, dando una banda más arriba que en la de agentes reductores.

Todos los geles de PAGE-SDS son discontinuos, en la parte superior presentan un gel concentrador o apilador y en la inferior un gel separador. El gel apilador permite concentrar todas las proteínas de la muestra en un espacio inferior al que ocupan en el pozo, de forma que las bandas sean más pequeñas y no solapen al separarse las proteínas en el gel separador, es decir, permite aumentar la resolución. Lo que ocurre es que en el gel concentrador nos es restrictivo y su pH es de 6.5, lo que hace que la glicina (el componente del tampón de la electroforesis que transporta la corriente) se haga neutra, por lo que ahora la corriente es transportada directamente por las proteínas que corren más rápido hasta alcanzar la interfase con el gel separador, donde todas se apilan. En este segundo gel, el pH es mayor, la glicina vuelve a estar cargada y las proteínas se separan. Electroenfoque

En este caso el gel posee un gradiente de pH en la dirección de la corriente. Cuando la proteína alcanza la zona donde el pH es igual a su pI, pierde su carga por lo que deja de moverse. Aunque la proteína se siguiese moviendo por difusión, al bajar se haría positiva y subiría, y viceversa, por lo que siempre se queda en el mismo punto. En este caso no es necesario el gel apilador, ya que las proteínas se separan muy específicamente, tampoco se pueden usar detergentes (ya que apantallan la carga de los aminoácidos, y esta no cambiaría al llegar al pH correspondiente al pI), y la concentración de acrilamida del gel debe ser muy baja, para que sea no restrictivo y solo se separen las proteínas por densidad de carga. Estos gradientes de pH no se generan por vasos comunicantes, sino que pueden ser:  

Autogenerados mediante anfolitos portadores: se van distribuyendo en el gel en función de su pI de forma que generan un gradiente de pH. Inmovilinas: son tiras de poliacrilamida que llevan fijados los anfolitos, de forma que al colocarlas ya se genera el gradiente de pH.

Geles bidimensionales

Se realiza una electroforesis en dos dimensiones:  

En primer lugar, se realiza un electroenfoque para separar las proteínas por pI. A continuación, se realiza una PAGE-SDS para separar las proteínas por tamaño, ya que puede haber proteínas diferentes con un mismo pI.

Como consecuencia, se obtiene un mapa de puntos en lugar de bandas. Son muy habituales en proteómica, ya que permiten separar las proteínas de una forma muy sensible (incluso se separaran proteínas de la misma familia que difieren en ciertas modificaciones postraduccionales como fosforilaciones). También permiten analizar diferencias en las proteínas de células normales y cancerosas, diferentes tipos celulares, células de individuos enfermos…: se observan diferencias en los geles de las

diferentes células, se recorta la parte del gel que contiene la proteína de interés y se analiza la proteína para poder identificarla....