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OBTENCIÓN DE DNA GENÓMICO A TRAVÉS DE PRECIPITACIÓN PORSALES (SALTING OUT) Y ANÁLISIS MEDIANTE CORRIDOELECTROFORÉTICO EN GEL DE AGAROSA.1 Estudiantes del Programa de Biología, Facultad de Ciencias Básicas, Universidad del Atlántico, Km 7, antigua vía Puerto Colombia, Atlántico, Colombia.RESUMENSe ex...

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OBTENCIÓN DE DNA GENÓMICO A TRAVÉS DE PRECIPITACIÓN POR SALES (SALTING OUT) Y ANÁLISIS MEDIANTE CORRIDO ELECTROFORÉTICO EN GEL DE AGAROSA. 1

Estudiantes del Programa de Biología, Facultad de Ciencias Básicas, Universidad del Atlántico, Km 7, antigua vía Puerto Colombia, Atlántico, Colombia.

RESUMEN Se extrajeron DNA genómico a partir de muestra de sangre donada por estudiantes y posteriormente fue conservada en tubos vacutainer con EDTA a 4°C. se siguió el protocolo de salting out dicho método requirió el uso de sustancias específicas para la lisis de glóbulos blancos y rojos, y del uso de la proteinasa K y la precipitacion por sales en este caso acetato de sodio para la purificación de DNA. Se realizó una cuantificación a través de un espectrofotómetro NanoDrop y se observó en una tabla los datos de las relaciones de absorbancia A280/A260, A260/A230 y concentraciones de ácido nucleicos de cada una de las muestras. Se realizó un corrido electroforético con un marcador de peso molecular de 1kb y una muestra control. Se analizaron los datos cuantitativos y cualitativos de cada uno de los procedimientos (Electroforesis y Espectrofotometría NanoDrop)

Palabras Claves: Extracción de DNA, Precipitación por sales, NanoDrop, Gel de agarosa.

INTRODUCCIÓN Los protocolos de extracción y purificación de ácidos nucleicos son esenciales para la mayoría de las aplicaciones en biología molecular. Este proceso es necesario para realización de Técnicas como PCR, micro arreglos y marcadores moleculares DNA como punto de partida. (Menossi et al., 2007) Para la obtención del DNA es necesario realizar purificación de la muestra descartando todo aquel residuo proteico e inhibidores que dificulten el posterior tratamiento de la molécula, para esto se han desarrollado diferentes protocolos dependiendo del tipo de muestra y las condiciones que esta requiera una de las más utilizada es la técnica de saltingout es la base de uno de los procedimientos de purificación proteica más utilizados (Voet & Voet, 2006). El fundamento físico y químico de la precipitación de proteínas por salado o

salting-out es el cambio de solubilidad que experimentan las proteínas cuando son sometidas a modificaciones en la concentración salina del medio, por lo que al someter la muestra a altas concentraciones de sales, la solubilidad de las proteínas presentes disminuye, terminan por precipitar y el pellet obtenido pueda ser empleado en estudios genéticos posteriores. Riera, Rojas y Zapata (2010) desarrollaron un protocolo modificado de extracción de DNA por salting-out en donde determinan las condiciones bajo las cuales es posible obtener DNA de alta pureza en volúmenes pequeños de sangre. Esta adaptación economiza reactivos, lo cual resulta conveniente para el desarrollo actividades académicas. Para visualizar la obtención y pureza de las moléculas de DNA se han desarrollado técnicas como la espectrofotometría es una técnica que mide la interacción de moléculas con la radiación electromagnética. La luz que se encuentra en la luz visible y la luz ultravioleta de los espectros electromagnéticos presenta una energía de 150- 400 kJmol-1. La energía de la luz es usada para promover electrones de un estado de excitación a otro. Un espectro es obtenido cuando la absorción de luz es medida en función de una frecuencia o longitud. Moléculas con electrones deslocalizados en sistemas aromáticos a menudo absorben la luz a 150-400 nm (ultravioleta) o en la región visible de 400-800 nm. (Arenas, 2004). Otra técnica que nos ayuda en extracción y purificación de los ácidos nucleicos es la electroforesis es una técnica de fraccionamiento que depende de la capacidad de las moléculas cargadas para migrar cuando se les someten a polos con diferentes cargas (+,-) (Karp, 2014). Existen diferentes tipos, en donde la electroforesis en gel se halla entre los mejores métodos para la separación analítica de macromoléculas (Voet & Voet, 2006). Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma; los materiales más comunes para separar sustancias de ácidos nucleicos son polímeros como la poliacrilamida o la agarosa (Padilla, Diez, Martínez, Bárcena & García, 2007). Es por esto, que en el desarrollo de la práctica del laboratorio de Biología Molecular se busca extraer DNA de alta calidad empleando la técnica de salting-out con volúmenes pequeños de sangre y verificando la presencia de ácidos nucleicos con espectrofotometría con NanoDrop y electroforesis en gel de agarosa al 0,5%. OBJETIVOS  

Comprender el fundamento de extracción de DNA a través de la técnica salting-out. Comprobar la presencia de DNA por medio de electroforesis en gel de agarosa y la espectrofotometría con NanoDrop.

MATERIALES Y METODO. Extracción del DNA Se llevó a cabo el protocolo Rapid Isolation Mammalian DNA (Molecular Cloning: A laboratory manual, 1990) con la adicción de proteinsa k a la mitad de los tubos eppendorf y el uso de Acetato de sodio para precipitación con sales. Se tomaron 10 ml sangre periférica tomadas estudiantes, posteriormente fueron depositadas en tubos vacutainer con EDTA conservadas a 4°C en una nevera, aproximadamente por 4 horas antes de ser depositadas en los tubos eppendorf. Se depositaron 300 µl de muestra de sangre en 24 tubos eppendorf y posteriormente se le adicionaron 900 µl de solución de lisis de glóbulos rojos a cada uno de ellos, se homogenizo con un movimiento suave de cada uno de los tubos por 10 minutos y se procedió a centrifugar a 16000 RPM durante 3 minutos, este último proceso se realizó una vez más durante 3 minutos. Se prosiguió con el descarte total del sobrenadante solo dejando en las paredes del eppendorf el pellet al cual se le añadió 600 µl de lisis de glóbulos blancos y suavemente se golpeó en las zonas del eppendorf donde se encontraba el pellet hasta que este se despendiera de la superficie del tubo, en un nuevo tubo eppendorf se le adicionó el contenido de los dos tubos eppendorf para tener un total de 12 muestras, el cual a la mitad se les añadió adicionalmente 200 µl de proteinasa k y la otra mitad solamente 200 µl de acetato de sodio. Para la muestras que contenían solamente acetato de sodio se centrifugo a 16000 RPM en 4°C por 5 minutos, luego se depositó el sobrenadante en un eppendorf que contenía 600 µl de isopropanol se realizó una agitación suave y se prosiguió a centrifugar a velocidad máxima por 1 minuto a 4°C. Luego se retiró el sobrenadante y al pellet se le agrego 600 µl de etanol al 70% se agito y se centrifugo a velocidad máxima durante 1 minuto a una temperatura de 4 °C. Luego de terminar la centrifugación el sobrenadante fue retirado y se le agrego al pellet 100 µl de TE (pH 7,6) y fueron conservada en el baño maría a 65° C por toda una noche. Para las muestras que se le añadieron proteinasa k fueron depositadas en baño maría a 65 °C directamente después de su añadidura y el día siguiente se realizaron los mismos pasos por el cual pasaron las muestras de acetato de sodio. Por último se verifico la pureza del DNA con un espectrofotómetro NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis. Este procedimiento se puede resumir como se observa en la Figura 1.

Figura 1. Etapas resumidas de la extracción de DNA Electroforesis Inicialmente se preparó el gel de agarosa con una concentracion 0.5%, con 0,45 gr de agarosa y 60 ml de buffer TAE, posteriormente se calentaron en un horno microndas hasta que se observara la agarosa disuelta, se le añadio 3 µl de bromuro de etidio. Se virtió el gel caliente (50-60º C) en la base de corrida. Luego se introduce el peine en la ranura correspondiente de la cámara del gel, se deja enfriar el gel por 30 min para que este se gelifique. Ya gelificado, se retira el peine del gel solidificado. Luego se añadió en el primer pocillo un marcador de peso molecular (MP) de 1kb, Figura 3. Se mezlco 5 µl de muestra previamente extraído y preservado con 1 µl de buffer de carga y posteriormente depositados las diferentes muestras en cada 1 de los pocillos, se selló la cámara y se le expuso a una carga de 70 voltios durante 2 horas. Como último paso se llevó el gel al fotodocumentador visualizar el corrido electroforético. En la Figura 2, se observa las etapas seguidas en esta técnica de forma general.

Figura 2. Etapas resumidas de la electroforesis en la práctica de laboratorio

RESULTADOS Y DISCUSION Para verificar la pureza de la extracción de DNA genómico utilizamos una NanoDrop el cual nos arroja los valores de absorbancia de cada una de la muestras, donde la relación A260/A280 es muy estable y se considera que un DNA de pureza óptima tiene un valor entre 1.8-2.0. Un DNA de pureza aceptable debe tener al menos una relación A260/280 superior a 1.6 e inferior a 2.0. Un valor en esta relación inferior a 1.6 se puede ver contaminados por compuestos aromáticos, fenoles y proteínas esto puede ser atribuidos a factores químicos o físicos como ejemplo los reactivos usados en la purificación del DNA. Y cuando se obtiene valores superiores a 2.1 en la relación A260/280 se podría deberse a la presencia de ARN en la muestra. A 230 nm absorben contaminantes como sale, fenoles o carbohidratos como las encontradas en los reactivos utilizados para la extracción como por ejemplo, el acetato de sodio. En general, se considera que el DNA es puro cuando la relación de A260/A230 se encuentra en los rangos de 1.5 a 2.2 según lo dicho por el banco nacional de adn Carlos III. Menor de 1.5 indicaría presencia de contaminantes en la muestra. No obstante, esta relación resulta mucho más variable que la relación A260/280 dependiendo de factores como la concentración de DNA o de la composición del tampón de resuspensión de la muestra y es por eso que esta se usa como un respaldo a la relación A260/280. Gracias a este equipo se logró obtener la concentración de Ácidos nucleicos (ng/ µl). Cómo podemos observar en la Tabla1, nuestros resultado arrojaron unas concentraciones variables de Ácidos nucleicos,

algunas de las muestras se encontraron dentro del rango de pureza óptimo y otras muestran impurezas posiblemente proveniente por sales del acetato de sodio. Tabla 1. Datos de cuantificación con espectrofotómetro NanoDrop, Blanco= muestra de agua, Control= muestra de Alejandro, *= Muestras con Proteinasa K. Mues tras Blanc o

Concentr A260/ ación AN A280 (ng/ µl) -0,39 0,57

A260/ A230 1,63

Contr ol

774,25

1,89

2,5

1*

132,88

1,87

2,25

2*

159,83

1,88

2,09

3*

87,22

1,86

2,43

4*

125,96

1,86

2,36

5*

34,79

1,82

2,85

6*

508,99

1,84

1,83

7

268,16

1,77

2,13

8

5,79

1,47

-2,05

9

6,66

1,79

-0,91

10

106,34

1,77

1,45

11

20,09

1,7

3,72

12

5,56

0,81

0,15

La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. En la electroforesis después de depositar las muestra con el buffer de carga en cada uno de los pocillos y someterlo a 70 voltios por 3 horas se puedo establecer la presencia de ácidos nucleicos por la corrida de las alícuotas de DNA a la hora de comparar cada una de las muestras con el marcador de peso molecular de 1Kb se puede observar que la mayoría de las muestras superan los 12000 pb lo cual es normal ya que nuestra muestra es de DNA genómico. Algunas bandas se pueden observar que hay residuo regado por toda ella, esto se les puede atribuir a la contaminación por sales o fenoles que ya fueron observadas en espectrofotometría con el NanoDrop. La banda 9* es una de las que más muestra residuos esto se le puede atribuir a algunas posibles razones, como un mal pipeteo ya que algunos estudiantes presentaron problemas a la hora de calibrar la micro pipeta con el buffer de carga y la muestra o en la resuspensión en la primeras fases de la extracción del DNA, Figura 3.

Fiugra 3. Producto de la electroforesis en gel de agarosa 0.5%, MP: Marcador de peso molecular, *: muestras con proteinasa k, 1: muestra de Alejandro.

CONCLUSIONES La práctica de laboratorio permitió la comprensión de la técnica de salting-out para la extracción de DNA y por medio de técnicas como la espectrofotometría en NanoDrop y la electroforesis en gel de agarosa se logró demostrar que efectivamente el protocolo salting out es efectivo y económico para la extracción de DNA genómico. A demás nos ayudó a comprender que función química y física cumple cada uno de los pasos seguido por el protocolo, y como estos protocolos pueden tener modificación para mejorar o acelerar los resultados de interés para nuestro estudio. Es necesario para la formación de un estudiante Biología familiarizarse con las principales técnicas de la biología molecular y los instrumentos que estas requieren, para así establecer relación entre lo teórico y lo practico conociendo las bases fundamentales de cada una de las técnicas y aplicándolas en el laboratorio. BIBLIOGRAFÍA 

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Arenas, I., & Lopez, J. (2004). Métodos de laboratorio, Espectrofotometría de absorción. Mexcio DF: Maestria en ciencias Bioquimicas, Universidad Nacional Autonoma de Mexico. Banco nacional de adn carlos III. Programa control de calidad de muestras. Universidad de salamanca. Karp, G. (2014). Biología Celular y Molecular (7th ed.). México DF: Mc Graw Hill. Menossi, M., Silva-Filho, M. C., Vincentz, M., Van-Sluys, M. A. and Souza, G. M. (2007). Sugarcane functional genomics: gene discovery for agronomic trait development. Int. J. Plant Gen. 2008:1-11. Osorio, J., Pachajoa, H., Hurtado P. (2013). Concentración y pureza del ADN de muestras sanguíneas en papel Whatman FTA almacenadas entre 1 a 3 años. Universidad del valle Padilla, C., Diez, J., Martínez, E., Bárcena, J., & García, C. (2007). Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y caracterización electroforética de DNA plasmídico (1st ed.). Córdoba: Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales.

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Riera, M., Rojas, M., & Zapata, P. (2010). Protocolo de extracción de DNA por salting-out para pequeños volúmenes de sangre. Cienc. Tecno., 14, 4-7. Voet, D. & Voet, J. (2006). Bioquímica (3rd ed., pp. 138-141). Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana....