Practica 4 - Nota: 8 PDF

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Disoluciones, siembra y preparación de muestra...

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UNIVERSIDAD NACIONAL “HERMILIO VALDIZÁN” ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL CURSO: Microbiología Ing. Eva Orizano Ponce /

Mori Bailón, Denis; Mori Bailón Diego PRÁCTICA N° 4: Disoluciones, siembra y preparación de muestra INTRODUCCIÓN Siembra Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen: Que se efectúen asépticamente, que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados Que se realicen solo los manipuleos indispensables, que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero o bien Flujo laminar. Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos del microorganismo a estudiar. Medios sólidos: Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa o caja de Petri y sobre el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este método se utiliza para microorganismos aerobios. Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersión. Una vez solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para cubrir la capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.). Este método se utiliza para microorganismos anaerobios facultativos y microaerofílicos. Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inóculo. Con ayuda de una espátula de Drigalsky se extiende el inóculo hasta su absorción total por el medio de cultivo. Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos aerobios estrictos. Siembra en estría: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido y se deja solidificar. Existen distintas técnicas para la siembra en estrías, el objeto es obtener colonias aisladas • Técnica A Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa, se quema el ansa, se enfría, se gira la placa a 90° y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el área sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de la placa. Por último, sin quemar el ansa, se estría el resto de la superficie sin sembrar. • Técnica B Con el ansa cargada se hacen 3 o 4 estrías; se quema el ansa, se hacen 3 o 4 estrías perpendiculares a las anteriores, se quema el ansa y se repite el procedimiento hasta agotar la superficie de la placa.(Ortega,2009) Procedimiento OBJETIVO Preparación de medio de cultivo Aplicar técnicas de diferentes tipos de aislamiento para la localización de microorganismos concretos en muestras contaminadas. 1. Se pesó el agar saboraud y el caldo peptona 2. Se diluyó en agua destilada cada uno en un MATERIALES Y MÉTODO matraz Erlenmeyer. 3. Se sumergió la muestra en el caldo peptona (el Materiales plátano hongueado en trozos) y se dejó  Plátano con hongos reposar unos minutos.  medio de cultivo caldo peptona 4. Se ajustó el pH del agar saboraud a 5.6 y el  medio de cultivo agar sabouraud del caldo peptona a 7.0  Microondas 5. Se taponeó el matraz con agar, con algodón y  Balanza gramera se selló con papel aluminio.  Papel toalla 6. Se acondicionó y se mandó a esterilizar a la  Espátula de digralsky autoclave.  Mechero 7. Se guardó a refrigeración.  Film  Pipetas Siembra por espátula de Drigalsky  Probetas 1. Se licuó los medios de cultivo en el  Placa Petri microondas con intervalos de tiempo (30 seg)  Tubos de ensayo 2. Se limpió la cámara de flujo laminar con  Agua destilada algodón humedecidas en alcohol de 70%.  Autoclave 3. Se alistó los tubos de ensayo y las placas Petri. 4. Se prendió el mechero en un radio de 15 cm 5. Se plaqueó los medios de cultivo, rotuló y esperó unos minutos hasta que se solidifiquen. 6.

Con el caldo peptona diluido y ajustado el pH, se pasó a hacer las diluciones sucesivas.

7.

Se

rotuló

9

tubos

de

ensayo

−9 −1 −2 −3 −4 −5 −6 −7 − 10 10 ,10 ,10 10 ,10 ,10 ,10 , con el método de diluciones sucesivas, se añadió 1 ml en el tubo 10−1 y de ese tubo de ensayo se pipeteo un ml al siguiente −2 y así sucesivamente. 10 8.

9.

−4

−5

−6

Se escogió los tubos 10 10 , 10 para luego sembrar con la espátula de Drigalsky en 6 placas petris. Se rotuló, selló con film y se puso en la incubadora por 5 días.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Aislamiento por espátula de Drigalsky Se observó un crecimiento regular microbiano en el cual se

Ilustración 1 pesado

Ilustración 4 método de diluciones sucesivas

observó un crecimiento mínimo de hongos. CONCLUSIONES Una de las actividades más apasionante del trabajo con hongos es el aislamiento de hongos. Entre los miles de especies que existen en la naturaleza el micólogo o el cultivador necesita aislar una para poder trabajar con ella. Para el que se inicia en esta actividad es bueno conocer las técnicas más usuales que le ayuden rápidamente a desarrollar su intuición y su habilidad. El aislamiento de hongos de la naturaleza es uno de los prime ros aprendizajes que debe adquirir quién desee trabajar con hongos. Ilustración 5 siembra en placa Petri por método Ilustración 2 dilución del agar en agua destilada

ANEXOS

Ilustración 3 dilución del caldo peptona en agua destilada

BIBLIOGRAFIA FACULTAD REGIONAL ROSARIODEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICACATEDRA DE BIOTECNOLOGIA Trabajo práctico n° 3“Siembra y recuento de microorganismos.”2009Jefe de Trabajos Prácticos: Ing. Marta Ortega...