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PRACTICA #6: CULTIVO DE EXUDADO NASALIntroducción:El diagnóstico microbiológico de laboratorio se sustenta en el estudio de lasmuestras obtenidas del paciente o portador, que propicia la identificacióndirecta o indirecta de los agentes casuales de la infección o enfermedadinfecciosa y en determinada...

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PRACTICA #6: CULTIVO DE EXUDADO NASAL Introducción: El diagnóstico microbiológico de laboratorio se sustenta en el estudio de las muestras obtenidas del paciente o portador, que propicia la identificación directa o indirecta de los agentes casuales de la infección o enfermedad infecciosa y en determinadas investigaciones información complementaria acerca de la sensibilidad o resistencia del microorganismo en cuestión a la acción de los fármacos antimicrobianos. El exudado nasal, es una prueba de laboratorio que consiste en sacar una muestra mucosa de las fosas nasales del paciente. Esta muestra solo se utiliza para buscar portadores de Sthaphylococcus aureus o en el diagnostico etiológico del impétigo. Es importante mencionar que alrededor del 30% de la población es portadora de este microorganismo a nivel nasofaríngeo por lo cual su hallazgo no tiene habitualmente significancia clínica salvo en situaciones especiales.

Objetivo: Realizar aislamiento y posteriormente la identificación, mediante el cultivo de las bacterias presentes en la muestra del exudado nasal.

Materiales y métodos: Materiales •Cubrebocas, guantes y lentes

•Abatelenguas •Hisopos estériles

•Mechero Bunsen, cubreobjetos

portaobjetos,

•Asa en punta y redonda •Cubre y portaobjetos

Método

1. Introducir un hisopo estéril en ambas fosas nasales, utilizando un hisopo diferente, uno a la vez. 2. Descargar hisopo en una división de la placa de Agar Sal Manitol aislando colonias con el asa en punta. 3. Etiquetar e incubar a 36°C por 24 horas. 4. Hacer prueba de la catalasa 5. Buscar: colonias pequeñas cremosas, amarillentas. 6. Sembrar en caldo BHI para realizar la prueba de la coagulasa 7. Incubar a 36°C por 18-24 horas.

8. Realizar tinción Gram del Caldo BHI 9. Adicionar un volumen similar de plasma incubar y observar la formación del coagulo (2h, 3h y 6h). Resultados

Fig. 1 Placa de agar Sal Manitol c crecimiento bacteriano posterior a incubación de 24 hrs.

Fig.2 Pr

Fig. 3 Tinción del caldo BHI fosa nasal izquierda. 100x

Fig. 4 Tinción del caldo B nasal derecha. 100x

Discusión de resultados Placa de Agar Sal Manitol. Se puede observar que la placa esta dividida en dos porciones, derecha e izquierda, esta división se debe a que se sembraron las bacterias de las fosas nasales derecha e izquierda respectivamente. Como se puede observar en la figura 1, macroscópicamente se puede observar que el color del agar viro de un color rosa-naranja a un color amarillo debido al metabolismo del manitol por las bacterias, lo que les confiere la característica de manitolasa + rasgo característico de bacterias de la familia Staphylococcaceae. Así mismo se puede observar el crecimiento de colonias bacterianas en ambas partes del agar, con similitudes morfológicas macroscópicas, presentan cierta convexidad, son redondas, tienen bordes regulares, consistencia butiracea, opaco, pigmento entre gris y amarillo. Prueba catalasa En la figura 2 se puede apreciar la prueba de catalasa realizada para cada grupo de bacterias del medio de cultivo, se observan dos pruebas, derecha e izquierda que representan las bacterias aisladas de cada fosa nasal derecha e izquierda respectivamente, ambas pruebas resultaron positivas, por ello se observan burbujas, por la acción de la enzima catalasa, que posee la bacteria, transformando el peróxido de hidrógeno en agua y oxigeno molecular. Tras realizar esta prueba confirmamos que nuestra bacteria problema se encuentra en la familia Staphylococcaceae posiblemente la especie aureus. Tinción del caldo BHI fosa nasal izquierda. 100x En la figura 3 se puede observar una tinción Gram positiva, otra característica principal de las bacterias de la familia Staphylococcaceae. Esta tinción se realizó del caldo BHI donde se cultivaron bacterias de la fosa nasal izquierda; en esta tinción se pueden observar una gran cantidad de bacterias Gram positivas, es decir teñidas de un color entre azul y violeta, con formas esféricas agrupadas en racimos de uvas, a los cuales se les denomina estafilococos Tinción del caldo BHI fosa nasal derecha. 100x La figura 4 consta de una tinción Gram positiva realizada del caldo BHI donde se desarrollaron las bacterias de la fosa nasal derecha; en esta tinción se observan escasas bacterias en comparación con la tinción realizada de la fosa nasal izquierda. Bacterias Gram +, por lo cual también es una prueba que nos ayuda a identificar a nuestra bacteria problema en la familia Staphylococcaceae; se observan de un color azul, poseen una forma esférica, se pueden observar

mayormente cocos aislados en toda la tinción, pero también pueden percibirse en forma de diplococos, agrupados en tétradas, incluso en forma de pequeños racimos, dispersos por todo el campo. Prueba coagulasa En la figura 5 representa la prueba de coagulasa, con un resultado negativo, con lo cual nuestra presunción anterior de que nuestras bacterias problema se trataban de Sthaphylococcus aureus, queda completamente descartada ya que esta prueba, coagulasa positiva es primordial para establecer la identificación de esta especie. Por lo cual tuvimos que analizar nuevamente las pruebas con las que contábamos para realizar la posible identificación de nuestras bacterias problemas, quedando como posible sospechosos las siguientes cepas: S. epidermidis, S. xylosus, S. saprophyticus S. cohnii, S. capitis S. simulans, S. warneri, S.auricularis, S. haemolyticus, las cuales son coagulasa negativa, no podríamos determinar cuál de estas es la de nuestra muestra, puesto que se necesitan realizar más pruebas para establecer la identificación correcta de nuestras bacterias problema. Por otra parte también pensamos en la inefectividad de nuestro caldo BHI, pero inmediatamente refutamos esta idea al ver que la fecha de caducidad aun no cumplía el tiempo indicado, así mismo pensamos que también pudo influir la pequeña cantidad de plasma añadido para la reacción (250microlitros), pudiendo influir esta para la observación de coagulasa positiva, pero también desechamos esta opción al saber que nuestros compañeros agregaron 2.5 ml de plasma y aun así les dio un resultado negativa a coagulasa.

Conclusión El proceso de identificación bacteriana es un proceso largo mas no complicado, pero que tiene mucha utilidad clínica, ya que se da la identificación del microorganismo que se padece en alguna enfermedad y así poder determinar el fármaco adecuado para combatir la infección de la mejor manera, es importante que este proceso se lleve a cabo de la forma correcta ya que alguna variación de este puede alterar los resultados de una manera importante. Por otra parte, nuestras pruebas realizadas a la muestra (exudado nasal) eran un tanto específicas para S. aureus, no obstante, obtuvimos un resultado inesperado y nuestras bacterias problemas no resultaron ser la que nosotros sospechábamos, nos es necesario realizar más pruebas para identificar el microorganismo problema.

Actividades que desarrollar

Fundamento del agar sal manito En el medio de cultivo, el extracto de carne, la peptona de carne y la tripteína, constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales que promueven el desarrollo microbiano. El manitol es el hidrato de carbono fermentable. El cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, el rojo fenol es el indicador de pH y el agar es el agente solidificante. Es un medio altamente selectivo por la alta concentración salina y diferencial debido a la capacidad de fermentación del manitol por los microorganismos. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color.

visualizan

Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o púrpura. Este medio de cultivo es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir de muestras clínicas, alimentos, productos farmacéuticos, cosméticos y otros materiales de importancia sanitaria.

Características bioquímica de las especies staphylococcus Son anaerobios facultativos, producen catalasa y coagulasas, son capaces de reducir el telurito a teluro metálico (por esto las colonias se tiñen de gris oscuro a negro), fermentan el manitol, produciendo la acidificación del medio, utilización de glucosa anaerobia. Fundamento prueba de la catalasa Es un método rápido y fácil para la diferenciación de Staphylococcus. Puesto que las bacterias correspondientes a Staphylococcus son catalasa positivo lo que nos sugiere que se puede tratar de este género, Su fundamento radica en que la enzima catalasa descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. De esta

manera las bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2, que es un producto final del metabolismo aerobio de los azúcares. Fundamento prueba de la coagulasa Comprueba la facultad de este organimso para coagular el plasma por acción de esta enzima. Esta prueba permite separar S. aureus, que posee coagulasa, de las

otras especies de estafilococos que genéricamente se las denomina estafilococos coagulasa negativos. El fundamento radica en que S. aureus posee dos tipos de coagulasa: a) Una endocoagulasa o coagulasa ligada o clumping factor, que está unida a la pared celular. Esta actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la formación de coágulos o grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma citratado. (test de lamina) b) Una exocoagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la activación de un factor sérico (CRF), formándose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibrinógeno produciéndose un coágulo de fibrina. (test de tubo)

Bibliografía     

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