Practica 8 (A,B,C). Electroforesis en gel de agarosa (AGE), Digestión de restricción, Extracción de ADN a partir de gel de agarosa PDF

Preview

Summary

Informe de prácticas de laboratorio...

Description

PRACTICA 8 A Electroforesis en gel de agarosa (AGE) Objetivo Separar los fragmentos de ADN en función de su peso molecular. Teoría La electroforesis en gel de agarosa es la forma más fácil y popular de separar y analizar el ADN. Aquí las moléculas de ADN se separan sobre la base de la carga aplicando un campo eléctrico al aparato electroforético. Las moléculas más cortas migran más fácilmente y se mueven más rápido que las moléculas más largas a través de los poros del gel y este proceso se llama tamizado. El gel puede usarse para observar el ADN con el fin de cuantificarlo o aislar una banda en particular. El ADN se puede visualizar en el gel mediante la adición de bromuro de etidio. La agarosa es un polisacárido obtenido del alga roja Porphyra umbilicalis. Su nombre sistemático es (1 4) -3, 6-anhidro-aL-galactopiranosil- (1 3) -β-D- galactopiranano. La agarosa forma una matriz inerte. La mayoría de los geles de agarosa se fabrican entre 0,7% y 2% de agarosa. Un gel al 0,7% mostrará una buena separación para fragmentos de ADN grandes (5-10 kb) y un gel al 2% mostrará una buena resolución para fragmentos pequeños con un rango de tamaño de 0,2-1 kb. Los geles de bajo porcentaje son muy débiles (Nota: pueden romperse cuando los levante), pero los geles de alto porcentaje suelen ser frágiles y no se fijan uniformemente. El volumen de agarosa requerido para una preparación de mini gel es de alrededor de 30-50 ml y para un gel más grande, alrededor de 250 ml.

Estructura de agarosa

Factores que afectan el movimiento del ADN: Voltaje aplicado La tasa de migración de los fragmentos de ADN lineal a través del gel de agarosa es proporcional al voltaje aplicado al sistema. A medida que aumenta el voltaje, también aumenta la velocidad del ADN. Pero el voltaje debe limitarse porque se calienta y finalmente hace que el gel se derrita.

Bromuro de etidio (EtBr) Es un agente intercalante que se intercala entre bases de ácidos nucleicos y permite la detección conveniente de fragmentos de ADN en gel. Cuando se expone a la luz ultravioleta, emitirá una fluorescencia de color naranja. Después de pasar el ADN a través de un gel tratado con EtBr, cualquier banda que contenga más de ~ 20 ng de ADN se vuelve claramente visible bajo luz ultravioleta. EtBr es un "mutágeno" conocido, sin embargo, existen alternativas más seguras. Puede incorporarse con geles de agarosa o muestras de ADN antes de la carga, para la visualización de los fragmentos. La unión del bromuro de etidio al ADN altera su masa y rigidez y, por tanto, su movilidad. Buffers Se han recomendado varios tampones diferentes para la electroforesis de ADN. Los tampones más utilizados son Tris-acetato-EDTA (TAE) y Tris-borato-EDTA (TBE). La tasa de migración de los fragmentos de ADN en ambos tampones es algo diferente debido a las diferencias en la fuerza iónica. Estos tampones proporcionan los iones para mantener la conductividad. Conformación del ADN El ADN con diferentes conformaciones que no se ha cortado con una enzima de restricción migrará con diferentes velocidades. El ADN circular cortado o abierto se moverá más lentamente que el ADN lineal y superenrollado (de más lento a más rápido: plásmido circular abierto, lineal o superenrollado). Los ADN circulares, circulares con muescas y lineales súper helicoidales migran los geles a diferentes velocidades a través del gel de agarosa. La nobleza relativa de estas tres formas depende de la concentración, el tipo de agarosa utilizado para hacer el gel, el voltaje aplicado, el tampón y la densidad de los giros súper helicoidales. Materiales necesarios: Tampones y soluciones: Soluciones de agarosa. Bromuro de etidio. Tampón de electroforesis. Ácidos nucleicos y oligonucleótidos: Muestras de ADN. Escaleras de ADN. (Las muestras de ADN de tamaño conocido se generan típicamente mediante digestión con enzimas de restricción de un ADN de plásmido o bacteriófago de secuencia conocida). El equipo y los suministros necesarios para realizar la electroforesis en gel de agarosa son relativamente simples e incluyen:



Una cámara de electroforesis y fuente de alimentación.



Bandejas de fundición de gel, que están disponibles en una variedad de tamaños y están compuestas de plástico transparente a los rayos UV.



Peines de muestra, alrededor de los cuales se vierte agarosa fundida para formar pocillos de muestra en el gel.



Tampón de electroforesis, generalmente Tris-acetato-EDTA (TAE) o Tris-boratoEDTA (TBE).



Tampón de carga, que contiene algo denso (por ejemplo, glicerol) para permitir que la muestra "caiga" en los pocillos de la muestra, y uno o dos tintes de seguimiento, que migran en el gel y permiten un control visual o hasta dónde ha avanzado la electroforesis.



Bromuro de etidio, un tinte fluorescente utilizado para teñir ácidos nucleicos.



Transiluminador (una caja de luz ultravioleta), que se utiliza para visualizar el ADN teñido con bromuro de etidio en geles.

NOTA: Utilice siempre gafas protectoras cuando observe el ADN en un transiluminador para evitar daños en los ojos por la luz ultravioleta. Para ello tomamos 2ml de solución madre de TAE en un matraz Erlenmeyer y hacemos el volumen a 100ml añadiendo 98ml de agua destilada. La solución de trabajo 1x es Trisacetato 40 mM / EDTA 1 mM Es importante utilizar el mismo lote de tampón de electroforesis tanto en el tanque de electroforesis como en la preparación del gel. Para esto, normalmente se añaden 2 gramos de agarosa a 100 ml de tampón de electroforesis. Concentración de agarosa en gel (% [p / v])

Rango de separación de moléculas lineales de ADN (kb)

0,3

5-60

0,6

1-20

0,7

0,8-10

0,9

0,5-7

1.2

0,4-6

1,5

0-2-3

2.0

0,1-2

(El gel debe tener un grosor de entre 3 y 5 mm. Compruebe que no haya burbujas de aire debajo o entre los dientes del peine). 1. Prepare una solución madre 50x de tampón TAE en 1000 m de H 2 O destilada : Para ello pesa 242 g de Tris base en una balanza química. Transfiera esto a un vaso de precipitados de 1000 ml. Prepare la solución de EDTA (pH 8,0, 0,5 M) pesando 9,31 g de EDTA y disuélvala en 40 ml de agua destilada. El EDTA es insoluble y se puede hacer soluble agregando gránulos de hidróxido de sodio. Verifique el pH usando un medidor de pH. Haga la solución de 100 ml agregando agua destilada. Pipetee 57,1 ml de ácido acético glacial. Mezcle la base Tris, la solución de EDTA y el ácido acético glacial y agregue agua destilada para que el volumen sea de 1000 ml. 2. Prepare suficiente tampón de electroforesis (generalmente 1x TAE) para llenar el tanque de electroforesis y para verter el gel: 3. Prepare una solución de agarosa en tampón de electroforesis a una concentración adecuada: 4. Tape sin apretar el cuello del matraz Erlenmeyer. Caliente la lechada en un baño de agua hirviendo o en un horno microondas hasta que la agarosa se disuelva. La solución de agarosa puede hervir muy fácilmente, así que siga revisándola. Es bueno detenerlo después de 45 segundos y darle un giro. Puede sobrecalentarse y NO hervir hasta que lo saque, después de lo cual hierve por todas sus manos. Así que use guantes y sosténgalo con el brazo extendido. Puede usar un mechero Bunsen en lugar de un microondas, solo recuerde seguir mirándolo. 5. Use guantes aislantes o pinzas para transferir el matraz / botella a un baño de agua a 55 ° C. Cuando el gel fundido se haya enfriado, agregue 0,5 µg / ml de bromuro de etidio. Mezcle bien la solución de gel agitando suavemente. (Para la preparación de bromuro de etidio, agregue 1 g de bromuro de etidio a 100 ml de H 2 O. Revuelva en un agitador magnético durante varias horas para asegurarse de que el tinte se haya disuelto. Envuelva el recipiente en papel de aluminio o transfiera los 10 mg / ml solución a una botella oscura y almacenar a temperatura ambiente). 6. Mientras se enfría la solución de agarosa, elija un peine apropiado para formar las ranuras de muestra en el gel. 7. Vierta la solución de agarosa tibia en el molde. 8. Deje que el gel se seque completamente (30-45 minutos a temperatura ambiente), luego vierta una pequeña cantidad de tampón de electroforesis en la parte superior del gel y retire con cuidado el peine. Vierta el tampón de electroforesis. Monte el gel en el tanque de electroforesis.

9. Agregue suficientes tampones de electroforesis para cubrir el gel a una profundidad de aprox. 1 mm. 10. Mezcle las muestras de ADN con 0,20 volúmenes del tampón de carga de gel 6x deseado. 11. Cargue lentamente la mezcla de muestra en las ranuras del gel sumergido utilizando una micropipeta desechable o una micropipeta automática o una pipeta Pasteur extraída o un tubo capilar de vidrio. Cargue los estándares de tamaño en las ranuras del lado derecho e izquierdo del gel. 12. Cierre la tapa del tanque de gel y conecte los cables eléctricos para que el ADN migre hacia el ánodo positivo (cable rojo). Aplique un voltaje de 1-5 V / cm (medido como la distancia entre los electrodos positivo y negativo). Si los electrodos están separados por 10 cm, ejecute el gel a 50 V. Está bien ejecutar el gel más lento que esto, pero no lo haga más rápido. Por encima de 5 V / cm, la agarosa puede calentarse y comenzar a derretirse con efectos desastrosos en la resolución de su gel. Si los cables se han conectado correctamente, se deben generar burbujas en el ánodo y el cátodo. 13. Ejecute el gel hasta que el azul de bromofenol y el xilencianol FF hayan migrado una distancia adecuada a través del gel. (La presencia de bromuro de etidio permite examinar el gel mediante iluminación UV en cualquier etapa durante la electroforesis). 14. La bandeja de gel se puede quitar y colocar directamente en un transiluminador. Cuando se enciende la luz ultravioleta, podemos ver bandas naranjas de ADN. Procedimiento para operar el laboratorio virtual: Compruebe si ha realizado todos los pasos que se enumeran a continuación: 

Prepare tampón TAE.



Transfiera 100 ml del tampón a un matraz cónico.



Pese 2 gramos de agarosa y agregue a la solución tampón de 100 ml.



Mantener en horno.



Saca la solución del horno.



Agregue bromuro de etidio.



Vierta la solución en una rueda de gel.



Coloca el peine.



Vierta la solución tampón de 100 ml en la cámara electroforética.



Coloque el gel en la rueda en la cámara electroforética.



Conecte los electrodos y encienda la corriente.



Apague la fuente de alimentación.



Retire el gel de la cámara electroforética.



Coloque el gel en el transiluminador UV.



Encienda el transiluminador.

PRECAUCIÓN: 

El bromuro de etidio es un mutágeno y debe manipularse como una sustancia química peligrosa (por lo tanto, use guantes durante la manipulación).

DIFERENCIAS ENCONTRADAS EN EL LABORATORIO REAL: 1. Asegúrese de que la agarosa esté completamente disuelta en el tampón. Si no se disuelve bien, vuelve a derretirlo un poco más para que se disuelva por completo. 2. Antes de verter el gel, la bandeja y el peine deben limpiarse con etanol. 3. Asegúrese de que el gel de la cámara esté sumergido en el tampón TAE. 4. Las etiquetas deben ser adecuadas. 5. Asegúrese de que las conexiones sean adecuadas. 6. Antes del paso de incubación, asegúrese de que el baño de agua esté configurado a la temperatura correcta que requerimos o no.

PRACTICA 8 B Digestión de restricción Objetivo: Para realizar la digestión de restricción de ADN con las enzimas EcoR I y BamHI. Principio: Las enzimas de restricción son nucleasas que pueden escindir la columna vertebral de azúcar y fosfato del ADN, que se encuentra en las bacterias. A medida que cortan dentro de la molécula, comúnmente se les llama endonucleasas de restricción. Escinden específicamente los ácidos nucleicos en una secuencia de nucleótidos específica llamada sitios de restricción para generar un conjunto de fragmentos más pequeños.

Las enzimas de restricción forman parte del sistema de modificación de restricción de las células bacterianas que proporciona protección contra la invasión de la célula por ADN extraño, especialmente el ADN de bacteriófago. Pero el ADN de las células no es escindido por estas enzimas de restricción. Esta autoprotección se logra con la ayuda de la enzima ADN metiltransferasa específica que metilará la secuencia de ADN específica para sus respectivas enzimas de restricción transfiriendo grupos metilo a residuos de adenina o citosina para producir N6-metiladenina o 5-metilcitosina. Una característica interesante de la endonucleasa de restricción es que comúnmente reconocen secuencias de reconocimiento que son en su mayoría palíndromos: muestran las mismas secuencias hacia adelante (5 'a 3' en la cadena superior) y hacia atrás (5 'a 3' en la cadena inferior). En otras palabras, Tipos de sistema de restricción y modificación (RM): Enzimas de tipo I: - Las enzimas de restricción de tipo I exhiben actividades de restricción y de modificación del ADN. Para su actividad, requieren cofactores como los iones Mg2 +, Sadenosilmetionina (SAM) y ATP. Las secuencias de reconocimiento son bastante largas sin características reconocibles como la simetría. Las endo nucleasas de restricción de tipo I escinden el ADN en sitios inespecíficos y eso puede tener 1000 pares de bases o más de la secuencia de reconocimiento. Sin embargo, debido a que la reacción de metilación la realiza la misma enzima que media en la escisión, el ADN diana puede modificarse antes de cortarse. Debido a estas características, los sistemas de tipo I tienen poco valor para la manipulación genética. Enzimas tipo II: - Las enzimas tipo II y su correspondiente modificación metiltransferasas actúan como proteínas separadas. Tienen una serie de ventajas sobre los sistemas de tipo I y III. Primero, la restricción y la modificación están mediadas por enzimas separadas, por lo que es posible escindir el ADN en ausencia de modificación. En segundo lugar, las

actividades de restricción no requieren cofactores como ATP o S-adenosilmetionina, lo que las hace más fáciles de usar. Solo requieren iones Mg2 + como cofactores. Estas enzimas son específicas del sitio ya que hidrolizan enlaces fosfodiéster específicos en ambas cadenas de ADN. Las endonucleasas de restricción de clase II se utilizan generalmente como material clave en biología molecular y técnicas de ADN recombinante, incluido el mapeo del genoma, el análisis RFLP, la secuenciación de ADN y la clonación. Enzimas de tipo III: - Al igual que las enzimas de clase I, las enzimas de tipo III poseen actividades de restricción y modificación. Reconocen secuencias específicas y escinden de 25 a 27 pares de bases fuera de la secuencia de reconocimiento, en una dirección 3 '. Requieren iones Mg2 + para su actividad. Las enzimas de tipo II tienen cofactores y estructura macromolecular similar a las de los sistemas de tipo II, el hecho de que la restricción se produzca a una distancia del sitio de reconocimiento limita su utilidad. Nomenclatura: Las primeras tres letras de la enzima de restricción se refieren al organismo del que se aisló originalmente la enzima de restricción, la cuarta letra (si está presente) se refiere a la cepa y los números romanos sirven como índices si el mismo organismo contiene varias enzimas de restricción diferentes. Por ejemplo, EcoR I y EcoR V son ambos de Escherichia coli, cepa R; I y V son el orden en que fueron descubiertos.

Nomenclatura de enzimas de restricción Fuente de enzima enzimática Eco RI

Escherichia coli , la cepa R, I st enzima

Hin dIII

Haemophilus influenzae , la cepa d, 3 rd enzima

Bam HI

de Bacillus amyloliquefaciens , la cepa H, I st enzima

Sma I

Serratia marcescens , I st enzima

Hae III

Haemophilus aegyptius , 3 rd enzima

Escisión de la enzima de restricción: Las enzimas de restricción de clase II generan tres tipos de extremos de ADN, todos con grupos 5´-fosfato y 3´-hidroxilo: a) Extremos 5´ cohesivos: - Por ejemplo, extremos generados por Eco R I:

b) Extremos 3´ cohesivos: - Por ejemplo, extremos generados por Pst I:

c) Extremos romos: - Por ejemplo, extremos generados por Hae III

Los extremos pegajosos (extremos romos) se producen cortando el ADN de manera escalonada dentro del sitio de reconocimiento produciendo extremos de ADN monocatenario. Estos extremos tienen una secuencia de nucleótidos idéntica y son pegajosos porque pueden unirse a colas complementarias de otros fragmentos de ADN cortados por la misma enzima de restricción.

Isosquizómeros y neoesquizómeros: Diferentes enzimas de restricción, aisladas de diferentes organismos pueden tener secuencias de reconocimiento idénticas, tales enzimas se denominan isosquizómeros. Los

neoshizómeros son enzimas isosquizoméricas pero se escinden en diferentes sitios de reconocimiento. Aplicaciones: Las enzimas de restricción son herramientas poderosas de genética molecular que se utilizan para: • Mapear moléculas de ADN • Analizar polimorfismos poblacionales • Reorganizar moléculas de ADN • Preparar sondas moleculares • Crear mutantes Factores que afectan la actividad de la enzima de restricción: Temperatura: La mayoría de las digestiones se realizan a 37 ° C. Sin embargo, hay algunas excepciones, por ejemplo, la digestión con Sma I se lleva a cabo a temperaturas más bajas (~ 25 ° C), mientras que con Taq I a una temperatura más alta, es decir, 65 ° C. Sistemas tampón: Tris-HCl es el agente tampón más utilizado en mezclas de incubación, que depende de la temperatura. La mayoría de las enzimas de restricción son activas en el rango de pH de 7,0 a 8,0. Condiciones iónicas: Mg2 + es un requisito absoluto para todas las endonucleasas de restricción, pero el requisito de otros iones (Na + / K +) varía con las diferentes enzimas. Metilación del ADN: la metilación de residuos específicos de adenina o citidina dentro de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción afecta la digestión del ADN. Actividad estrella: Es una alteración de la especificidad de la escisión del ADN mediada por enzimas de restricción que puede ocurrir en algunas condiciones no estándar que difieren de las óptimas para la enzima. Esta alteración conduce a la escisión en sitios no específicos. Las condiciones no estándar incluyen: 1. pH alto (> 8,0). 2. Concentraciones de glicerol> 5% (importante, porque las enzimas generalmente se administran como stock concentrado en 50% de glicerol). 3. Alta concentración de enzima (> 100 U / µg de ADN). 4. Tiempo de incubación prolongado con enzima. 5. Presencia de disolventes orgánicos en la reacción (por ejemplo, fenol, cloroformo, etanol, DMSO). 6. Cofactor incorrecto (es decir, Mn2 +, Hg2 + o Co2 + en lugar de Mg2 +). Para evitar la actividad de las estrellas, utilice siempre el sistema tampón óptimo y la cantidad de enzima recomendada. Asegúrese de que la preparación de ADN esté libre de disolventes orgánicos y sales contaminantes.

PRACTICA 8 C Extracción de ADN de gel de agarosa Objetivo Extraer bandas específicas de ADN de geles de agarosa en los que se separan mediante electroforesis. Teoría El aislamiento del ADN es un paso crítico en biología molecular. Es necesario obtener un fragmento de ADN específico a partir del ADN extraído en técnicas de biología molecular. Después de aislar los plásmidos, puede contener algo de contaminación de ADN cromosómico que interrumpirá el procesamiento posterior de la clonación. Por tanto, es mejor recuperar el ADN plasmídico eluyéndolo de geles de agarosa (extracción). El primer paso para extr...