Práctica de Punto Isoeléctrico PDF

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Practica para determinar el punto isoelectrico de proteinas...

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PUNTO ISOELÉCTRICO DE PROTEÍNAS INTRODUCCIÓN: La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica (caseinato cálcico). La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en composición de la leche líquida. La caseína está formada por alpha(s1), alpha(s2)-caseína, ß-caseína, y kappa-caseína formando una micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se añade la kappa caseína a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo de caseína que es solubilizado en forma de micela. Esta micela está estabilizada por la kappa caseína mientras que las alfa y beta son fosfoproteínas que precipitan en presencia de iones calcio. La función biológica de las micelas de caseína es transportar grandes cantidades de Ca y P altamente insoluble en forma líquida a los lactantes y formar un coagulo en el estómago para favorecer una nutrición eficiente. Además de caseína, Ca y P la micela formada también contiene citrato, iones, lipasa, enzimas plasmáticos y suero. Estas micelas ocupan del 6-12% del volumen total de la leche. Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que adquieren depende del pH del medio. Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible). Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos. Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lisina estarían protonados (-NH3+). De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2). De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI). En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación. OBJETIVOS: 1. Determinar el pI de diferentes proteínas. 1. Observar el efecto del alcohol como agente precipitante. MATERIAL:  9 tubos de ensaye

 1 gradilla. REACTIVOS:  Caseinato de sodio 0.1 N  Ácido acético: 0.01 N, 0.1 N, 1.0 N.

 Agua destilada

DESARROLLO: DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA CASEINA. Preparar 9 tubos como lo indica la tabla siguiente NÚMERO DE TUBO REACTIVOS.(ml.) Agua destilada Ac acético 0.01 N Ac acético 0.1 N Ac acético 1.0 N

1 8.38 0.62 -----

2 7.75 1.25 -----

3 8.75 --0.25 ---

4 8.5 --0.5 ---

5 8 --1 ---

6 7 --2 ---

7 5 --4 ---

8 1 --8 ---

9 7.4 ----1.6

Agitar los tubos y agregar 1 ml de solución de caseína (Caseinato de sodio 0.1 N). Agitar los tubos inmediatamente. Observar los enturbiamientos que se producen después de agitar, esperar 15 minutos y anotar los resultados marcando con "0" la falta de turbidez, marcar con una "+"· los grados de turbidez y con una "X" la precipitación. El pH de cada tubo se determina usando la ecuación de Henderson Hasselbach. RESULTADOS Se utilizará la fórmula de Henderson-Hasselbach para obtener el pH de cada uno de los tubos.

pH= pK +log

[ A´] [ HA]

Donde A ´ es la concentración de caseína, HA la concentración de ácido acético y el pK en este caso es del ácido acético igual a 4.7 Tubo 1

pH=4.7 +log

[ 0.1] =5.7 [ 0.01 ]

Tubo 2

pH=4.7 +log

[ 0.1] =5.7 [ 0.01 ]

Tubo 3

pH=4.7 +log

[ 0.1] =4.7 [ 0.1 ]

Tubo 4

pH=4.7 +log

[ 0.1] =4.7 [ 0.1 ]

Tubo 5

pH=4.7 +log

[ 0.1] =4.7 [ 0.1 ]

Tubo 6 Tubo 7 Tubo 8 Tubo 9 DISCUSIÓN La conformación de la caseína es similar a las proteínas desnaturalizadas globulares, la caseína no contiene puentes disulfuro. El alto número de residuos de prolina en la caseína causa un especial plegamiento en la cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria ya que esta es importante para la estabilidad de la caseína frente a la desnaturalización por calor. La carencia de estructura terciaria facilita la situación al exterior de los residuos hidrofóbicos lo que facilita la unión entre unidades proteicas y la convierte en prácticamente insoluble en agua. Teóricamente ya se conoce que el punto isoeléctrico, es aquel valor de pH al cual su carga eléctrica neta es cero, y se ha demostrado por medio de la presente práctica, la validez del resultado, puesto que nuestro pH obtenido en práctica, se asemeja o acerca al valor de pH teórico de la leche al ser acidificada (de 4,6) La caseína se asienta, o precipita, en una solución en su punto isoeléctrico porque el polo positivo de una molécula proteica atrae el polo negativo de otra, provocando que las moléculas se unan. El punto isoeléctrico es el punto en el cual el número de cargas positivas, en la molécula proteica, iguala al número de cargas negativas. En otras palabras, es el punto en el cual la molécula proteica es eléctricamente neutra. Para determinar el punto isoeléctrico de la caseína utilizamos el ácido acético, lo cual nos permitió que la caseína se acidifique y disminuya el pH hasta llegar a un punto de equilibrio que en este caso es de 4,6. CONCLUSIONES Habiendo llevado a cabo ésta práctica pudimos observar que los tubos 8 y 9 de la caseína fueron los únicos que presentaron cambios, notándose una precipitación mayor que en los demás tubos y por esto pudimos determinar su punto isoeléctrico, pues existe una concentración de iones de hidrogeno, o un pH, en el cual la proteína no tiene ninguna carga eléctrica y al no presentar carga entonces esta proteína no puede interactuar con el medio, se vuelve insoluble y precipita. Se pudo comprender que la neutralización de la caseína se debe fundamentalmente a la adición del ácido acético. Las proteínas se pueden precipitar mediante un agente precipitante de carga opuesta a la de las éstas; se requiere que el pH de la solución debe ser controlado de tal modo que la proteína quede en el lado ácido o básico de su punto isoeléctrico. Pudo determinarse que el punto isoeléctrico de la caseína se encuentra entre los dos tubos previamente mencionados y que tiene un valor de 4.6. CUESTIONARIO: 1. Defina pI de una proteína. Existe un pH para el cual la carga eléctrica media de las moléculas es cero. Este pH se llama punto isoeléctrico (pI). El pI es el pH en el que la molécula se disocia por igual en ambos sentidos, y como equidista de los dos valores de pK. 1. Escriba la ecuación de Henderson Hasselbach.

2. ¿Por qué el alcohol actúa como agente precipitante para la gelatina? La gelatina, es una mezcla heterogénea de proteínas, de alto peso molecular, todas son proteínas solubles en agua, y el agua está incorporada dentro de las moléculas individuales de los aminoácidos, lo que hace su carácter de gel. Al agregar suficiente alcohol etílico, se rompen las uniones de las moléculas, pues el agua se mezcla con el alcohol, y las proteínas precipitan, además de no ser solubles en alcohol. 3. ¿Por qué presentan diferentes valores de pI las proteínas? Todos los aminoácidos tienen estructuras diferentes. Lo que nos permite conocer el punto isoeléctrico es el valor de pKa de los radicales carboxilo y amino. El pKa es el valor de pH en el que los radicales perderán protones, confiriéndole al aminoácido cargas negativas o neutras. No todos los aminoácidos tienen el mismo número de radicales, por lo tanto, sus puntos isoeléctricos no pueden ser iguales....