Práctica Piruja - en esta practica se puede observar y cuantificar reacciones enzimticas ante PDF

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en esta practica se puede observar y cuantificar reacciones enzimticas ante un inhibidor y ante un desaoplante...

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Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Medicina BIOQUÍMICA Grupo: 1123 PRÁCTICA 4 Estudio del bombeo de protones por levaduras. Integrantes: Cerón Rodríguez Axel Espino Hernández Jesús Mauricio Espino Martínez Sebastián Tapia Figueroa Eleazar Ugalde Navarrete Hermes Alejandro

Objetivos: 1.- Que el alumno relacione el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por levaduras. 2.- Que el alumno describa las vías por las cuales la glucosa genera los cambios de pH. 3.-Que el alumno interprete el efecto de los inhibidores y los desacoplantes sobre la salida de protones. Preguntas previas: 1. Los aminoácidos,carbohidratos, además de cierta acción por parte del nitrógeno y de algunas vitaminas. De segunda fuente se pueden mencionar a la glucosa,fructosa, galáctosa, manosa, maltesa y sacárosa. Respecto al Nitrógeno se puede resaltar la acción del amonio y la urea. 2. La glucólisis y la fosforilación oxidativa 3. Glucolisis: Es la vía en la que la glucosa se va degradando progresivamente mediante la acción de varias enzimas. Consiste de 10 reacciones enzimáticas las cuales convierten a la glucosa en dos moléculas de piruvato que son capaces de seguir otras vías y seguir brindando energía al organismo. Fosforilación oxidativa: Consiste en la utilización de energía liberada por la oxidación de nutrientes para sintetizar ATP 4. Dióxido de carbono, agua y ATP 5. Complejo I: Rotenona y Pieridicina A Complejo II: Antimicina Complejo III: Cianuro, CO y Ácido Sulfúrico 6. Disocian la asociación de la oxidación en la cadena respiratoria

Hipótesis: La glucosa tendrá un papel importante en el experimento , ya que las levaduras la utilizan para producir ATP, por medio de la enzima ATPasa de H+. Si se interrumpe este proceso metabólico con la presencia de inhibidores (Azida) y desacoplantes (Dinitrofenol) en nuestra cadena transportadora de electrones, se espera observar una disminución progresiva en el pH extracelular, debido a la acumulacion aparente de H+ que no llegaron a síntesis de ATP.

Resultados PH Tiempo

Control

Dinitrofenol

Azida de Sodio

inmediato (basal)

6.63

5.96

6.12

3 min (basal)

6.54

5.78

6.06

6 min (basal)

6.51

5.74

5.85

AGREGAR 5 ML DE GLUCOSA inmediato

6.5

5.71

5.7

5 minutos

6.43

5.25

5.65

10 minutos

6.2

4.97

5.62

15 minutos

6.0

4.83

5.6

20 minutos

5.84

4.74

5.54

30 minutos

5.62

4.51

5.27

40 minutos

5.42

4.3

5.01

Análisis de los resultados. Para dar un análisis de resultados completo primero hay que entender el proceso metabólico de nuestro organismo en estados normales, es decir sin la presencia de inhibidores y desacoplantes. de una manera muy breve ya que el objetivo de esta práctica no es del todo de este aspecto, sin embargo es necesario entenderlo. la glucosa entra por medio de proteínas transmembranales, con su posterior fosforilación como glucosa 6 fosfato, esta se conducirá al proceso metabólico de glucólisis con resultados finales de Pyr y NADH, la primera se dirigirá a la fermentación láctica o alcohólica, mientras que la segunda por medio de la lanzadera malato/ lactato se dirigirá a la matriz intercelular de la mitocondria para la formación de acetaldehído. Una vez ahí se enfrentará a la cadena transportadora de electrones para la formación de ATP, y por medio de la enzima traslocasa se dirigira a su hidrolisis y posterior liberación de protones o H+. ¿Que ocurre en presencia de inhibidores y desacoplantes? Antes que nada hay que tener en cuenta que nuestro primer compuesto dinitrofenol actúa como un desacoplante, y el Azida como un inhibidor de la cadena de electrones, es decir en palabras más coloquiales, uno atrofia la membrana mitocondrial, mientras que el otro detiene totalmente el proceso de conversión.

por otro lado están las levaduras, organismos aerobios capaces de sintetizar ATP a partir de glucosa, mediante la transferencia de electrones. Pero… ¿A qué se debe la disminución de PH a medida que pasaba el tiempo? o mejor aun ¿cual es el proceso a nivel microscópico que puede explicar tales hechos? empecemos definiendo un inhibidor que corresponderia a nuestra primera parte del experimento. un inhibidor es un complejo capaz de detener o disminuir la actividad de producción, ya que actúa sobre puntos específicos en nuestra cadena de electrones, dependiendo del tipo será el complejo que se verá afectado. Por otro lado tenemos a los desacoplantes, estos actúan de diferente manera, pues no son capaces de suspender totalmente la producción, pero si de dañarla, el efecto de este tipo de sustancias es la inhibición de la producción de ATP al no generarse el gradiente de PH, sin embargo, si permite que la cadena de electrones continúe funcionando, es decir, impide la relación existencial entre la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa. es por ello que permite el paso de H+ del espacio intermembranal hacia la madriz, lo que lleva a una disminución de la misma, disminuyendo el ATP. Primeramente, en nuestra segunda columna de la tabla anterior encontramos al desacoplante, y se observa que progresivamente el ph baja, ¿porque sucede tal hecho? resulta que cuando nuestro desacoplante se aproxima a la membrana interna se protona, debido al ambiente existente, lo que ocasiona la activación de su blanco de acción, la membrana mitocondrial, crea fugas de H+ en toda nuestra membrana, lo que provocará que los electrones no pueden fluir por el canal protónico, y por consiguiente disminuya la presencia de ATP, es por esta razón que se observa la disminución constante del ph, la concentración de H+ favorece un ambiente ácido. despues esta el Azida, un inhibidor, que va a tener como blanco de acción el complejo 4 (COX) de nuestra cadena de electrones, esta acción es más fácil de explicar, y lo planteamos de la siguiente forma: cada complejo de nuestra cadena de electrones es capaz de generar un gradiente electroquímico, formando un potencial para generar trabajo y por supuesto generar energía mediante la fosforilación oxidativa, al tratarse de una CADENA, significa que para que se lleve a cabo debe haber un orden y deben estar sujetos a un pacto de interdependencia, es decir, si uno llegase a fallar (con excepción de 2) la cadena no se llevaría a cabo, y por consiguiente el gradiente de protones para la posterior síntesis de ATP sería nula. Ahora… ya se explicó la inhibición de ATP, pero ¿Como explicas la disminución constante del potencial de hidrógeno? esta disminución se debe a la sencilla razón de que los protones que ya se encuentran en la matriz provienen de otros complejos que están funcionando normalmente, pero debido a que estos no avanzan al siguiente paso, se quedan acumulados, juntandose y juntandose cada vez más, lo que conducirá a la presencia de altas concentraciones de hidrogeniones en la membrana mitocondrial. Es por esta razón que existe una gran diferencia entre la producción de ATP en células anaerobias que aerobias, debido a que en las primeras solo hay glucólisis y en la segunda hay ausencia del ciclo del ácido cítrico, donde solo existe glucólisis y cadena de transporte.

Conclusión :

En conclusión pudimos determinar que los objetivos de esta práctica se cumplen, ya que fuimos capaces de describir, relacionar e interpretar la cadena de producción de ATP así como la influencia de los desacoplantes e inhibidores como el Dinitrofenol y la Azida de Sodio, capaces de dañar la relación entre la cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa o en su defecto formando vías de escape en la membrana de la mitocondria. Y con ello llegamos a la comprobación de nuestra hipótesis planteada en un inicio, la presencia de inhibidores (Azida) y desacoplantes (Dinitrofenol) en nuestra cadena transportadora de electrones, provocó una disminución progresiva en el pH extracelular, debido a la acumulacion aparente de H+ los cuales no llegaron a síntesis de ATP. Causante de la disminución de el pH, por que la

concentración de protones se hace mayor. Para comprobar si el desacoplante y el inhibido funcionan, se usa glucosa debido a que la levadura hacen glicolisis y en este proceso se reducen moléculas que después van a donar esos electrones es por eso que se deben medir los cambios de pH. Bibliografía: http://bjofjsicaguj]]ermocordero.b]ogspot. com StryeTt Bengi Lubeit. Bioquímica 10ma edición, cap.18 - Fosforilación oxidativa, 2008. Stryer, Bengt Lubert. Bioquímica lOta edición, cap.18 - Fosforilación oxidativa, 20UK. Stryer, Beng, Lubert, Bioqufnüca lOta edición, cap,l& - Fosforilación oxidativa, 200S...