Protocolo de prácticas de laboratorio Virtual de Bioquímica PDF

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Buen trabajo...

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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA

Protocolo de práctica de laboratorio Virtual de Bioquímica

201103 – BIOQUÍMICA

LEONARDO BONILLA RAMÍREZ Director

MEDELLÍN Abril, 2020

1. ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO La presente Guía para implementación virtual del laboratorio de bioquímica fue diseñada por Biólogo, Magister y Doctor en Ciencias Biomédicas Leonardo Bonilla Ramírez, docente de la UNAD, ubicado en el CEAD de Medellín, actualmente se desempeña como tutor de la UNAD. Esta guía utiliza el simulador libre Biomodel desarrollado por el doctor Ángel Herráez de la Universidad de Alcalá (UAH) – España que puede ser consultado en la página http://biomodel.uah.es. Las guías fueron aprobadas por la red de curso de bioquímica y la red curricular de fundamentos de química para el periodo 16-01 2021. Este documento se puede copiar, distribuir y comunicar públicamente bajo las condiciones siguientes: ✓ Reconocimiento. Debe reconocer los créditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). ✓ No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. ✓ Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. ✓ Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los términos de la licencia de esta obra. ✓ Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor. ✓ El contenido de este protocolo de laboratorio no menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

2. INDICE DE CONTENIDO

Pág. 3. Características generales

5

4. Descripción de prácticas

9

4.1. Práctica 1. Determinación de la concentración de carbohidratos y proteínas. 9 4.2. Práctica 2. Separación electroforética de isoenzimas de LDH sobre acetato de celulosa. 16 4.3. Práctica 3. Ensayo de Cinética enzimática: Determinación de la actividad gamma-glutamiltranspeptidasa en una muestra de orina. 22 4.4. Práctica 4. Ensayo de viabilidad celular (actividad metabólica) por reducción del compuesto MTT. 28

3. Características generales

Introducción

El componente práctico del curso de bioquímica comprende el espacio académico para afianzar y consolidar las competencias adquiridas por el estudiante en el componente de formación básica de estudiantes de los programas de ingeniería de alimentos y regencia de farmacia. A través del desarrollo de las prácticas el estudiante aplicará conceptos de la bioquímica, relacionados con biomoléculas, enzimología y metabolismo celular, tales como estructura, pH, reacciones de oxidoreducción, cinética e inhibición enzimática y catabolismo celular. De igual manera, el componente práctico favorece en los estudiantes el desarrollo de habilidades observacionales, analíticas y experimentales en el área de la bioquímica. Durante el desarrollo de las prácticas favorecerá afianzar conceptos y competencias adquiridas en cursos previos como biología y química orgánica, para así lograr las competencias necesarias en la formación en ciencias básicas para el óptimo desarrollo de sus programas académicos. El diseño de este protocolo de laboratorio se realizó con el propósito de complementar y correlacionar los conceptos teóricos con los resultados experimentales del curso de bioquímica de la cadena de Ciencias Básicas de la escuela de Ciencias Básicas tecnología e ingeniería de la Universidad Nacional Abierta y a Distancia. Este protocolo consta de 4 prácticas que integran los temas de las tres unidades temáticas del curso. Los contenidos de las prácticas fueron seleccionados, teniendo en cuenta el tiempo y las competencias metodológicas mínimas que se esperaría debe alcanzar un estudiante de la Universidad en el campo de la bioquímica.

Justificación

Es requisito para los estudiantes en formación en ingeniería de alimentos y tecnología en regencia de farmacia. Propósito:

Intencionalidades Relacionar los procedimientos de laboratorio con los formativas conceptos sobre biomoléculas, enzimología y metabolismo a través de ensayos experimentales. Objetivo general: Desarrollar en el estudiante la capacidad analítica para relacionar las medidas experimentales del laboratorio de bioquímica, con los conceptos teóricos aprendidos. Meta: Aplicar los conceptos relacionados con la bioquímica en ensayos experimentales simulados y análisis de resultados experimentales teóricos que evidencien la relación teoría-práctica. Resultado de Aprendizaje: Aplicar los conceptos teóricos de la biomoléculas, enzimología y metabolismo a partir del desarrollo de actividades experimentales con mediación tecno pedagógica.

Denominación de prácticas

Práctica 1. Determinación de la concentración de carbohidratos y proteínas Práctica 2. Separación electroforética de isoenzimas de LDH sobre acetato de celulosa. Práctica 3. Ensayo de Cinética enzimática: Determinación de la actividad gammaglutamiltranspeptidasa en una muestra de orina Práctica 4. Ensayo de viabilidad celular (actividad metabólica) por reducción del compuesto MTT

Número de horas

18

Porcentaje

La nota de las actividades del laboratorio corresponde al 28% del curso, equivalente a 140 puntos de 500 Totales.

Curso Evaluado por proyecto

Informe o productos a entregar

SI___

NO_X_

El desarrollo del laboratorio virtual de bioquímica se realiza de manera individual. Deberá entregar un ÚNICO informe que contenga todas las prácticas de laboratorio en el Aula virtual de componente práctico. Este informe deberá contener: o Portada o Desarrollo de la cada una de prácticas o Conclusiones por cada una de prácticas

las las

El informe deberá ser entregado 2 días después de finalizada la última sesión de laboratorio programada. Sistema de Evaluación La evaluación se llevará a cabo por medio de las siguientes actividades: 1. El tutor asignado al componente práctico virtual evaluará el laboratorio de acuerdo con la presentación del informe de la práctica donde deberá dar desarrollo a todas las prácticas desarrolladas. La valoración de la práctica se dará con un con una ponderación de 120 puntos de acuerdo con la Guía y rúbrica de evaluación del componente práctico virtual. 2. Desarrollo de la evaluación en línea para cada práctica a través de formularios de Google con un peso de 20 puntos de acuerdo con la Guía y rúbrica de evaluación del componente práctico virtual Rúbrica de evaluación La evaluación estará a cargo de los tutores de laboratorio siguiendo la Guía y Rúbrica de Evaluación de la tarea 5 – componente práctica y la calificación será visible en el OIL

4. DESCRIPCIÓN DE PRÁCTICAS 4.1. Práctica 1. Determinación carbohidratos y proteínas

de

la

concentración

de

Tipo de práctica

Puntaje evaluación Horas de práctica Temáticas práctica

de

Presencial Autodirigida Otra Simulada ¿Cuál 30 puntos

la

Remota

cinco

de la Concentración de carbohidratos y proteínas en solución

Intencionalidades formativas

Propósito Relacionar las propiedades estructurales y químicas de los aminoácidos y proteínas, a partir de procedimientos de laboratorio que describen su comportamiento bioquímico. Objetivo general. Determinar biomoléculas

concentración

de

las

Fundamentación Teórica Antes de iniciar el desarrollo de la práctica debe visualizar el vídeo que se encuentra a continuación donde se explican los fundamentos de las técnicas que se realizaran en esta práctica. Vídeo de Espectrofotometría Universidad de Malaga, 2017. Técnicas básicas en Bioquímica: espectrofotometría [archivo de video] recuperado en https://www.youtube.com/watch?v=fXjP10sdmQU Peñaranda L. 2020. Práctica # 5: Cuantificación de proteínas [Archivo de vídeo] recuperado en https://youtu.be/NH7BBGUXqos

El estudiante debe revisar los fundamentos que incluye el simulador previo al desarrollo de la práctica Descripción de la práctica Esta práctica analizará la concentración de carbohidratos y proteínas empleando la técnica de espectrofotometría UV-VIS y la interpretación de espectros Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos) Computador con conexión a internet Software para utilizar en la práctica Simulador en línea Herráez A. s.f. Biomodel. Laboratorios virtuales. Espectrofotómetro UV-VIS Virtual [disponible en línea] disponible en http://biomodel.uah.es/lab/abs/ensayo.htm Metodología Procedimiento. 1. Ingrese al simulador de espectrofotometría UV-VIS en el siguiente enlace http://biomodel.uah.es/lab/abs/ensayo.htm y deberá observar en su computador el simulador como se muestra en el la figura 4.

Figura 1. Simulador de espectrofotómetro UV-VIS disponible en línea http://biomodel.uah.es/lab/abs/ensayo.htm

2. Leer atentamente la pestaña de instrucciones e ingrese a los enlaces compartidos sobre el uso de los equipos de laboratorio (pipetas pasteur, micropipetas y espectrofotómetro) y visualice los vídeos de los tres temas. 3. Proceder a realizar las tres actividades propuestas en las siguientes pestañas, siguiendo paso a paso las instrucciones dadas por el simulador: Glucosa. Determinación de la concentración de glucosa por un método enzimático colorimétrico Glucemia. Determinación de la glucemia (concentración de glucosa en sangre) Lowry. Determinación de la concentración de proteínas por un método colorimétrico: método de Lowry 4. Registra las tablas y los datos obtenidos en el desarrollo del experimento. No olvide registrar el número del experimento que le corresponde. Este número lo encuentra en el espacio Análisis de resultados Nota: Recuerde tomar capturas de los datos y espectros en cada fase del proceso en cada actividad. 5. Responder los interrogantes que encuentra en cada actividad en los ítems Análisis de resultados. Consignar su respuesta en el informe de la práctica Evaluación de la Práctica Una vez desarrollada la práctica deberá ingresar al siguiente enlace registrar sus datos y responder las preguntas https://forms.gle/eGNMN1n5KzNMr6d89

4.2. Práctica 2. Separación electroforética de isoenzimas de LDH sobre acetato de celulosa. Tipo de práctica

Puntaje evaluación Horas de práctica

Presencial Autodirigida Otra Simulada ¿Cuál de

30 puntos

la

Cuatro

Remota

Temáticas de la Propiedades químicas y estructurales de práctica aminoácidos y proteínas Intencionalidades Propósito formativas Relacionar las propiedades estructurales y químicas de los aminoácidos y proteínas, a partir de procedimientos de laboratorio que describen su comportamiento bioquímico. Objetivo general. Analizar el efecto de la fuerza iónica sobre proteínas en solubilidad acuosa.

Fundamentación Teórica La electroforesis es una técnica que permite separar sustancias cargadas por influencia de un campo eléctrico externo. La separación electroforética se basa en la diferente velocidad de migración que experimentan en un campo eléctrico las distintas partículas largadas eléctricamente. La velocidad de migración depende principalmente de la densidad de carga y de la intensidad del campo eléctrico aplicado. Debido a la naturaleza anfolítica, la carga eléctrica de las proteínas se modifica con el pH del medio, definiéndose entonces como punto isoeléctrico (pI), al pH en el cual la molécula no tiene carga eléctrica neta y entonces no migrará en un campo eléctrico. Si el pH se encuentra por debajo de la pI, predominan las cargas positivas y a la inversa a un pH superior al pI.

En esta técnica, la muestra está obligada a desplazarse sobre un soporte sólido de papel, celulosa o gel. La pequeña cantidad necesaria de muestra permite que las moléculas migren en discretas zonas o bandas. La electroforesis zonal de biomoléculas cargadas, generalmente se lleva a cabo en una disolución estabilizada con un medio que sirve de soporte. La muestra se aplica sobre una tira de papel de filtro humedecido con una disolución tampón, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel, dependiendo de las sustancias a separar y del pH del tampón. Los extremos de la tira se sumergen en dos recipientes separados que contienen la disolución tampón y en los que se hallan colocados los electrodos. Se conectan los electrodos a una fuente de tensión continua y se aplica una diferencia de potencial durante el tiempo adecuado. Al aplicar una corriente directa, las moléculas cargadas de la mezcla emigran hacia los electrodos de polaridad opuesta formando bandas en el papel. La velocidad de emigración de una molécula depende preferentemente de su carga. Completada la electroforesis, se desconecta la fuente de tensión y se secan las tiras sobre una superficie, limpia, seca y lisa (cristal, azulejo, etc...). El revelado se realiza empleando los mismos métodos que los utilizados en cromatografía sobre papel, mediante la acción de los colorantes adecuados. La electroforesis y la cromatografía en papel tienen ciertas similitudes. Sin embargo, mientras que la electroforesis separa las moléculas fundamentalmente en función de su carga, la cromatografía lo hace en base a una amplia gama de características (ejemplos, solubilidad en la cromatografía de reparto, polaridad en la de adsorción, carga en la de intercambio iónico, etc.). La electroforesis en papel se emplea principalmente en la separación de sustancias de bajo peso molecular como aminoácidos y péptidos. La difusión que se produce puede disminuirse aumentando la diferencia de potencial entre los electrodos con lo que se reduce el tiempo de desarrollo. Este tipo de electroforesis se denomina de “alto voltaje”. El revelador para localizar las sustancias sería la ninhidrina en el caso de péptidos y aminoácidos. Las electroforesis en papel también pueden hacerse en tiras de acetato de celulosa, que son químicamente más homogéneas y

tienen la ventaja de ser transparentes, con lo que las sustancias a separar, una vez teñidas o reveladas, pueden cuantificarse por densitometría. Es muy útil en los laboratorios clínicos por su fácil manipulación y su rápido desarrollo. La principal aplicación es la separación de proteínas del suero, conociéndose el resultado como proteinograma. Las fracciones proteicas del suero que se separan mediante este tipo de electroforesis son la albúmina y las globulinas α1, α2, β y γ. El acetato de celulosa se utiliza también para separar lipoproteínas. El resultado obtenido se denomina lipidograma. Las fracciones lipoproteicas son denominadas β, pre-β y γ. El tampón más usado es el veronal, a pH 8,6. La separación se realiza de forma análoga a la de proteínas y se produce en unos 30 minutos. Las lipoproteínas, una vez separadas, se localizan tiñéndolas con colorantes que se unen a la fracción lipídica, como “Negro Sudán” o “Ciba 7B Fat Red”. Electroforesis análogas a las de proteínas y lipoproteínas, utilizando como soporte el acetato de celulosa, se han aplicado también para la separación de isoenzimas de la lactato deshidrogenasa y la creatinquinasa. Descripción de la práctica En esta práctica se va a estudiar el efecto de la fuerza iónica sobre las propiedades químicas y estructurales de las proteínas Mediante el análisis de la separación de proteínas por métodos electroforéticos y el análisis de densitogramas. Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos) Computador con acceso a internet Software a utilizar en la práctica Simulador en línea Herráez A. s.f. Biomodel. Laboratorios virtuales. Simulador de electroforesis de proteínas sobre acetato de celulosa [disponible en línea] disponible en http://biomodel.uah.es/lab/acetato/LDH_aplicar_muestras.htm Metodología Procedimiento. 1. Ingrese al simulador de espectrofotometría UV-VIS en el siguiente enlace

http://biomodel.uah.es/lab/acetato/LDH_aplicar_muestras. htm y deberá observar en su computador el simulador como se muestra en el la figura 1.

Figura 2. Simulador de electroforesis de proteínas sobre acetato de celulosa disponible en línea http://biomodel.uah.es/lab/acetato/LDH_aplicar_muestras.htm 2. Leer atentamente las instrucciones 3. Proceder a realizar el experimento con las dos de las tres muestras (M1, M2 y M3) 4. Registra las gráficas obtenidas en el desarrollo del experimento. No olvide registrar el número del experimento que le corresponde. 5. Ingrese al enlace “en esta página” que se encuentra en el ítem “Fundamento”, esto lo llevara a otra parte del simulador que observa en la figura 3. El enlace directo a este segundo simulador es http://biomodel.uah.es/lab/acetato/LDH.htm

Figura 2. Simulador de electroforesis de proteínas sobre acetato de celulosa disponible en línea http://biomodel.uah.es/lab/acetato/LDH.htm 6. Utilizando los perfiles normales compare la separación de las proteínas en la tira de acetato de celulosa y los densitogramas para encontrar el tejido al cual corresponden cada una de las muestras M1, M2 o M3 de su experimento. Evaluación de la Práctica Una vez desarrolle la práctica ingrese al siguiente enlace registrar sus datos y responder las preguntas https://forms.gle/9gN5hpj8RSwGNHKc8

4.3. Práctica 3. Ensayo de Cinética enzimática: Determinación de la actividad gamma-glutamiltranspeptidasa en una muestra de orina Tipo de práctica

Puntaje evaluación Horas práctica Temáticas práctica

Presencial Autodirigida Otra Simulada ¿Cuál de

30

la

Cinco

de de

Intencionalidades formativas

Remota

la Actividad enzimática - Cinética enzimática Km Propósito Relacionar los conceptos básicos de enzimas y actividad enzimática a partir de procedimientos de laboratorio que describen el comportamiento bioquímico de las enzimas. Objetivo general. Relacionar actividad enzimática con parámetros físicos de velocidad y tiempo

Fundamentación Teórica La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente, la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción (Figura de la derecha). Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero (Figura de la derecha). De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad. Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la vel...