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Reporte de práctica...

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UVM Zapopan

Escuela de ciencias en la salud Universidad del Valle de México

Dellaneira Carolina Sánchez Macías Asignatura: Inmunología Licenciatura QFBT Periodo 2020-I Fecha de entrega: 31-03-2020 Docente: Dr. Víctor Hugo Siordia Sánchez

Introducción Los ensayos inmunológicos son procedimientos en los cuales se utilizan anticuerpos como reactivos enlazantes específicos. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utiliza como sus siglas lo indican una enzima como marcador para mediar la formación de complejos antígeno-anticuerpo. Existen diversas variaciones al método de ELISA para detectar y cuantificar ligandos de alto peso molecular (>30 000 daltons), el marcador enzimático que se emplea en estos análisis se conjuga con un ligando, que puede ser un antígeno, un anticuerpo específico para el antígeno de interés o un anticuerpo para el anticuerpo primario. La prueba ELISA se basa en varias teorías: 1)El antígeno y anticuerpo pueden enlazarse a una superficie portadora insoluble y retener su reactividad inmunológica

2)las enzimas tienen actividad específica alta y convierten una cantidad relativamente grande de sustrato en producto detectable, lo que permite detectar concentraciones muy bajas del ligando 3) la actividad enzimática o reactividad inmunológica de los conjugados se preserva y permanece estable durante el análisis y el almacenamiento 4) las enzimas no están presentes en el líquido biológico que se va a analizar. Los anticuerpos utilizados en el método ELISA son de origen monoclonal o policlonal que se suministran como antisuero no fraccionado o fracciones de inmunoglobulina purificada, pueden ser solubles o estar inmóviles en un soporte sólido, son empleados como conjugados no marcados o enzimáticos y por ultimo reaccionan con determinante antigénico específico de un antígeno o de un anticuerpo ligando-específico

UVM Zapopan Método Elisa directo e Indirecto Placas de revestimiento Agregar una solución de proteína de 2-10 μg / ml disuelta en un tampón alcalino, como solución salina tamponada con fosfato (ph 7.4) o carbonato. tampón de bicarbonato (ph 9.4). El tampón no contiene otras proteínas que puedan competir con el antígeno diana por la unión a la placa de micro título. Los antígenos que no son de naturaleza proteica se unirán a la placa de microposillo durante la incubación a 37°C Lavado Vaciando los pocillos con solución salina tamponada con fosfato neutro (PBS) o agua desionizada. Buffer de bloqueo Tween 20 (0.05%) por sí mismo es más efectivo en el bloqueo que cualquier proteína probada, pero debido a que la combinación de proteína y Tween 20 puede ser más efectiva que Tween 20 sola en algunos casos, se incluye albúmina de suero bovino (BSA; 0.25%) en el búfer de bloqueo. Las placas recubiertas pueden usarse inmediatamente o secarse y almacenarse a 4 ° C para su uso posterior. Anticuerpo primario adición de anticuerpos de detección (muestra de prueba) dirigidos contra el antígeno recubierto. Lavado Lavado y luego se agrega la solución de bloqueo Anticuerpo secundario

Escuela de ciencias en la salud Adición de anticuerpo secundario, diluido en tampón de bloqueo dirigido contra el anticuerpo primario. Seguido de incubación para lograr la unión del anticuerpo secundario conjugado con enzima. Lavado Agregar sustrato Adición de una solución de sustrato adecuada para la enzima particular conjugada con los anticuerpos. El objetivo es permitir el desarrollo de la reacción del color a través de la catálisis enzimática. Solución de parada Alterar el ph del sistema. La solución de parada se usa para terminar la reacción del sustrato enzimático para aplicaciones ELISA después de alcanzar la intensidad de color deseada Cuantificación espectrofotómetros diseñados especialmente que leen a través de los pocillos de micro título ya sea individualmente o en filas. Elisa Sándwich Placas de revestimiento agregar una solución de proteína de 2-10 μg / ml disuelta en un tampón alcalino como solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) o carbonato. tampón de bicarbonato (pH 9,4). Lavado Vaciando los pocillos con solución salina tamponada con fosfato neutro (PBS) o agua desionizada. Buffer de bloqueo Tween 20 (0.05%) por sí mismo es más efectivo en el bloqueo que cualquier proteína probada, pero debido a que la

UVM Zapopan combinación de proteína y Tween 20 puede ser más efectiva que Tween 20 sola en algunos casos, se incluye albúmina de suero bovino (BSA; 0.25%) en el búfer de bloqueo. Solución antígeno Este paso implica la adición de la detección de antígenos solubles (en la muestra de prueba) que se dirige contra el anticuerpo recubierto. El antígeno generalmente se diluye en tampón de bloqueo para evitar la unión no específica de proteínas en el antisuero en la fase sólida. Lavado Anticuerpo Adición de conjugado enzimático de anticuerpos, diluido en tampón de bloqueo dirigido contra el antígeno. Sustrato Adición de una solución de sustrato adecuada para la enzima particular conjugada con los anticuerpos. El objetivo es permitir el desarrollo de la reacción del color a través de la catálisis enzimática. Solución de parada Se detiene la reacción al alterar el pH del sistema. Cuantificación Espectrofotómetros diseñados especialmente que leen a través de los pocillos de microtitulación ya sea individualmente o en filas. Varios lectores de placas ELISA están disponibles, con niveles crecientes de sofisticación.

Escuela de ciencias en la salud Resultados Anexo 1

UVM Zapopan Anexo 1 Elisa indirecto

Elisa directo

Escuela de ciencias en la salud

UVM Zapopan Elisa sándwich

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