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GUIA PARA LA VERIFICACION DE ESPECTOFOTOMETROS UV-VISIBLE UTILIZADOS EN EL ANALISIS DE SUELO Y AGUA.

Azcarate M.P.(1); Kloster N.S. (2) ; Ostinelli M. (3); Carreira D. (3) 1

Laboratorio de Análisis Agronómicos. E.E.A. Chubut. INTA. Ex Ruta 25 Km 1480. (9100) Trelew. Chubut. Argentina. EMail: [email protected] 2 Laboratorio de Suelo y Agua. E.E.A. Anguil, INTA. RN Nº5 km 580. (6326) Anguil. La Pampa. Argentina. E-Mail: [email protected] 3 Laboratorio de Suelos. Instituto de Suelos. INTA Castelar. Las Cabañas y De Los Reseros s/n (1712) Villa Udaondo. Castelar. Buenos Aires. Argentina. E-Mail: [email protected]; [email protected].

ÁREA TEMÁTICA. (Marque una opción) REQUISITOS TÉCNICOS 3. Campo de aplicación RESUMEN. La espectrofotometría es una técnica ampliamente utilizada en los laboratorios para el análisis cuantitativo de numerosos compuestos, debido principalmente a su sencillez operativa y a la rapidez en el análisis. La concentración de una sustancia puede ser calculada a partir de la cantidad de luz absorbida por una muestra, en el rango del espectro del ultravioleta (UV) y visible (Vis) aplicando la ley de Lambert-Beer. Por ello, para generar datos confiables es de gran importancia la verificación previa del funcionamiento del espectrofotómetro. Los principales parámetros a controlar en estos equipos son: la exactitud de la longitud de onda, la exactitud y precisión fotométrica, la linealidad fotométrica y la verificación de la luz difusa o parásita. PALABRAS CLAVE. Espectrofotómetro. UV-Vis. Verificación. Suelo. Agua

1. Introducción En el análisis de muestras de suelo y agua, el espectrofotómetro constituye una herramienta fundamental para la cuantificación de nutrientes y contaminantes. Del correcto desempeño de este instrumento dependerá en gran medida la calidad de los resultados obtenidos, por lo que se considera un equipo crítico en los ensayos de laboratorio y que necesariamente deberá ser verificado periódicamente. 2. Objetivos El objetivo de ésta guía es proporcionar información útil para verificar el correcto funcionamiento de los espectrofotómetros UV-Vis del laboratorio.

Espectrofotómetros UV-Vis utilizados para el análisis de muestras de suelo y agua para uso agropecuario. 4. Fundamentos 4.1. Equipamiento La mayoría de los instrumentos espectroscópicos, como el espectrofotómetro, están constituidos por cinco componentes: lámpara o fuente luminosa, selector de longitud de onda , celda para alojar la muestra, detector de radiación, y amplificador de señal con medidor o registrador. 4.2. Teoría Desde hace muchos años se han utilizado las propiedades de la luz y su interacción con las sustancias para identificarlas y determinar la concentración de las mismas. Estos estudios se basan en la estrecha relación que existe entre la absorción de la radiación electromagnética de las sustancias, tanto en la zona del espectro visible como en el ultravioleta e infrarrojo, y su concentración. Si un haz de luz monocromático paralelo (I0) atraviesa una cubeta de b cm de paso óptico, conteniendo una solución con una concentración (c) de una especie absorbente. A causa de la interacción de la luz y de las partículas absorbentes la intensidad del haz se atenúa de I0 a I. La transmitancia (T) de la solución es entonces la fracción de la radiación incidente transmitida por la solución: T = I / I0 (1) También puede expresarse en forma porcentual: T (%) = I / I0 x 100 (2)

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A fin de obtener ecuaciones de ajuste lineal se utiliza su transformada logarítmica conocida como absorbancia (A) de una solución y definida por la ecuación A = - log T = log I0/I (3)

suficiente agua destilada. Adicionar, con cuidado, 10 ml de ácido sulfúrico (d = 1,84 g cm-3), y trasvasar cuantitativamente la solución a un matraz aforado de 1 litro. Enrasar con agua destilada y homogeneizar. 5.1.3. Solución de ácido sulfúrico 0,005 mol L-1

La absorbancia de una solución aumenta cuanto mayor es la atenuación del haz de luz, ocurriendo lo inverso en la transmitancia. La absorbancia es directamente proporcional a la longitud b de la trayectoria a través de la solución, y a la concentración c de la especie absorbente. Estas relaciones se expresan en la ley de Lambert-Beer como:

Pesar en un vaso de precipitados 0,49 g de ácido sulfúrico (d = 1,84 g cm-3), diluir con agua destilada y trasvasar cuantitativamente a un matraz de 1 litro. Enrasar con agua destilada y homogeneizar. 5.1.4 Soluciones de Dicromato de potasio

A = εbc (4)

a) Solución de concentración 0,10 g L-1 -1

-1

ε = absortividad molar expresada en L mol cm b = distancia recorrida a través de la solución (paso óptico) expresada en cm c = concentración de la solución expresada en mol L-1, 5. Desarrollo El Responsable del Sistema de Gestión de Calidad del Laboratorio (SGC) deberá definir el programa de verificación del equipamiento del laboratorio, en el cual incluirá las actividades a realizar, sus responsables y la periodicidad de los controles. Esta última se define en función de las condiciones de uso y el registro acumulado de funcionamiento de los equipos. Las principales pruebas recomendadas en la bibliografía consultada, para verificar el correcto funcionamiento de un espectrofotómetro incluyen: la exactitud de la longitud de onda, la exactitud y precisión fotométrica, la linealidad fotométrica y la verificación de la luz difusa o parásita. 5.1. Soluciones de calibración Se encuentran disponibles en el mercado, materiales de referencia certificados de estas soluciones, aunque las mismas se pueden preparar en el laboratorio a partir de reactivos de alta pureza y cuyas propiedades físicas y químicas sean conocidas. Para materiales sin evidencia formal de la trazabilidad (y su incertidumbre) es responsabilidad de los laboratorios demostrar que los mismos son aptos para el fin previsto. 5.1.1. Solución de óxido de holmio en ácido perclórico. Disolver en un vaso de precipitados 4,0 g de óxido de holmio (III) en 96,0 g de ácido perclórico al 10% (v/v). Calentar y agitar para facilitar su disolución y luego dejar en reposo por 24 hs, a temperatura ambiente. 5.1.2. Solución de sulfato de cobre en ácido sulfúrico. Disolver en un vaso de precipitados 20,0 g de sulfato de cobre pentahidratado, de una pureza mayor al 99,9%, en

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Secar aproximadamente 1 g de dicromato de potasio, de una pureza mínima de 99,95%, en estufa a 105 ºC por 2 horas y enfriar en desecador. Pesar 0,10 g y disolver en un vaso de precipitados con la solución de ácido sulfúrico 0,005 mol L-1. Trasvasar cuantitativamente a un matraz de un litro, enrasar con la solución de ácido sulfúrico 0,005 mol L-1 y homogeneizar. b) Serie de soluciones de Dicromato de potasio Preparar cuatro soluciones de dicromato de potasio de diferente concentración, requeridas para los controles, a partir de la solución de 0,10g L-1, tal como se indica en la tabla 1, enrasando a un volumen final de 100 ml con ácido sulfúrico 0,005 mol L-1. Tabla 1. Serie de soluciones de dicromato de potasio. Concentración (g L-1)

ml de solución de concentración 0,10 g L-1

0,02 0,04 0,06 0,08

20 40 60 80

5.1.5. Solución de Nitrito de sodio Secar aproximadamente 70 g de nitrito de sodio en estufa a 105ºC por 2 horas y enfriar en desecador. Pesar 50 g, disolver en un vaso de precipitados con agua destilada y trasvasar cuantitativamente a un matraz de un litro. Enrasar con agua destilada y homogeneizar. 5.2. Parámetros 5.2.1 Control de la exactitud de la longitud de onda La desviación de la longitud de onda puede causar errores en los resultados cuantitativos de la lectura en el UV-Vis. En este control se verifica el grado de concordancia entre la longitud de onda seleccionada para la máxima absorbancia y la longitud de onda de referencia. Con una misma cubeta, ajustar el cero (0) del instrumento

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con la solución de ácido perclórico al 10%. Se recomienda medir según el rango espectral una longitud de onda para el espectro UV y tres longitudes de onda para el espectro Vis. Dependiendo del ancho de banda del equipo, la máxima absorción de la solución de óxido de holmio en ácido perclórico se detectará a las longitudes de onda indicadas en la tabla 2. Tabla 2. Longitudes de onda (λ) de máxima absorción de la solución de óxido de Holmio en ácido perclórico. Ancho de banda (nm)

λ de máxima absorción (nm)

1 2

241,1 241,0

249,9 250,1

278,1 278,1

1 2

385,6 386,0

416,3 416,9

451,4 451,3

Rango UV 287,2 333,5 287,6 333,5 Rango Vis 467,8 485,2 468,1 485,2

361,3 361,1

536,6 537,2

640,5 641,1

La exactitud fotométrica se determina comparando la absorbancia de una solución de referencia (Tabla 3) con la lectura de ésta, obtenida en el espectrofotómetro. Para cubrir satisfactoriamente el rango UV-Vis del espectro, se utilizan dos soluciones diferentes: dicromato de potasio, para el espectro UV y sulfato de cobre, para el espectro Vis. Tabla 3. Absorbancias de referencia de las soluciones en el rango UV-Vis

Rango Vis Solución de sulfato de cobre en ácido sulfúrico

Longitud de onda (nm) 235

Absorbancia de Referencia 0,748

257 313 350 600 650 700 750

0,865 0,292 0,640 0,068 0,224 0,527 0,817

Con una misma cubeta ajustar el 0 de absorbancia del instrumento con la solución de ácido sulfúrico de concentración 0,005 mol L-1, utilizada para preparar las soluciones de referencia. •

•

5.2.3. Control de la precisión fotométrica Se denomina precisión fotométrica a la medida de la dispersión de una serie de mediciones de absorbancia alrededor de la media, y se expresa como coeficiente de variación porcentual. Para la determinación, utilizar los datos obtenidos en la prueba de exactitud fotométrica (5.2.2), con la solución de dicromato de potasio de 0,06 g L-1 a las siguientes longitudes de onda: 235, 257, 313, 350 nm. 5.2.4. Control de la linealidad fotométrica

345,4 345,5

5.2.2. Control de la exactitud fotométrica

Rango UV Solución de dicromato de potasio en ácido sulfúrico

valores y confrontándolos con los valores de referencia.

Control en el rango UV: Realizar 6 lecturas consecutivas de la solución de dicromato de potasio en ácido sulfúrico de concentración 0,06 g L-1 a las longitudes de onda de 235, 257, 313 y 350 nm, registrando los valores y confrontándolos con los valores de referencia. Control en el rango Vis: Realizar 6 lecturas consecutivas de la solución de sulfato de cobre en ácido sulfúrico a las longitudes de onda de 600, 650, 700 y 750 nm, registrando los

El estudio de la linealidad fotométrica permite establecer el rango de absorbancia en el que el instrumento tiene respuesta proporcional a los cambios de concentración. Para ello se determina la respuesta del espectrofotómetro a diferentes concentraciones de una sustancia que cumpla con la ley de Lambert-Beer. Se evalúa la linealidad fotométrica realizando lecturas de absorbancia de la serie de soluciones de dicromato de potasio (0,02; 0,04; 0,06; 0,08 y 0,1 g L-1), utilizando la solución de ácido sulfúrico 0,005 mol L-1 para realizar el ajuste a 0 de absorbancia del equipo. Las longitudes de onda a que se realizan las lecturas serán: 235, 257, 313 y 350 nm. 5.2.5. Control de Luz difusa o parásita Se denomina así a toda radiación electromagnética de longitud de onda distinta a la seleccionada por el monocromador, que alcanza el detector y por lo tanto queda registrada por el instrumento. Este control se basa en la medida del porcentaje de transmitancia de una solución de nitrito de sodio 50 g L-1. Esta sustancia tiene la propiedad de que sus soluciones absorben toda la radiación incidente de longitudes de onda menores a los 390 nm, es decir, que es ópticamente opaca a la luz. Por lo tanto, la transmitancia a 340 nm de esta solución debe ser igual a cero, y toda transmitancia detectada corresponde a luz parásita. El ajuste del equipo a 0 de transmitancia se realiza con aire, luego se mide la transmitancia de la solución de nitrito de sodio a una longitud de onda de 340 nm. Realizar las lecturas por triplicado. 6. Resultados En la tabla 4 se muestran los cálculos y los resultados aceptables en la verificación del funcionamiento del espectrofotómetro. Estos valores de aceptabilidad de los parámetros, fueron tomados de bibliografía relacionada con la industria farmacéutica y de lineamientos de la farmacopea de diferentes países.

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Tabla 4. Cálculos y evaluación de resultados de verificación de espectrofotómetros. Parámetros Exactitud de la longitud de onda Exactitud fotométrica Precisión fotométrica Linealidad fotométrica

Cálculos E = λm- λref %Error = Am – Aref 100 Aref CV% = SD .100 x Graficar Am vs Aref. Calcular con una regresión lineal el coeficiente de regresión (r).

Resultados Aceptable: UV ± 1 nm Vis ± 3 nm Error entre ± 2% Optima Error entre ± 3% Aceptable CV%...