T3. Control DEL Ciclo Celular PDF

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Profesor: Rafa Daga...

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T3. CONTROL DEL CICLO CELULAR La reproducción celular ocurre en una elaborada serie de eventos llamados ciclo celular donde los cromosomas y otros componentes celulares son duplicados y después repartidos en dos células hijas. Una compleja red de proteínas reguladoras gobierna la progresión por los distintos pasos del ciclo celular. Todas las células provienen de otra célula y cada célula viva de hoy se piensa que todas descienden de una única célula ancestral que vivió hace 3-4 mil millones de años. Desde entonces, en este vasto periodo de tiempo, la evolución de las células y organismos ha dependido de la transmisión de la información genética durante la división celular La reproducción celular es fundamental para el desarrollo y función de la vida. En organismos unicelulares la división celular genera un nuevo organismo completo. En el desarrollo de organismos multicelulares, un número incontable de divisiones transforman una única célula fundadora en una comunidad diversa de células que conforman los tejidos y órganos. En organismos adultos, la división celular reemplaza células que mueren por causas naturales o son dañadas por el ambiente. La mayoría de los componentes celulares, orgánulos, membranas, proteínas y RNAs son continuamente replicados durante el ciclo celular; lo que conlleva que el tamaño celular aumente en el ciclo. (G1 y G2). El DNA de la célula también se duplica en un periodo discreto del ciclo. La fidelidad de la replicación depende no sólo de que: - el DNA se duplique - Segregue correctamente, - Existan mecanismos reguladores que aseguren que el orden de eventos durante un ciclo celular. Para asegurar que los eventos ocurran en el orden y tiempo adecuado existe una compleja red de regulación conocida como la Maquinaria de Control del Ciclo Celular. En la forma más simple, la programación del sistema de control es independiente de los eventos que controla. En la mayoría de las células, el orden y la alternancia de eventos durante el ciclo dependen de la consecución de eventos previos. Por ejemplo, la Mitosis sólo comienza después de que la fase S se haya completado (además la célula tiene que alcanzar una tamaño determinada antes de entrar en mitosis). Las células poseen mecanismos que chequean la progresión por el ciclo celular y transmiten esta información a la maquinaria de control del ciclo celular. Si el sistema de control detecta problemas para completar un evento, el sistema de control retrasará el inicio de un evento posterior hasta que los problemas se resuelvan. Estos puntos de control de denominan CHECKPOINTS, suponen un periodo de tiempo en el que la célula tiene la oportunidad de arreglar errores o mutaciones ocurridos a lo largo del ciclo. Durante la división celular existen una serie de problemas que las células deben resolver para conseguir una segregación fiel de la información genética a las células hijas: 1. Los cromosomas deben ser duplicados una vez (y sólo una) por ciclo celular 2. Los cromosomas deben ser transmitidos igualitariamente a las dos células hijas de modo que cada célula hija herede una copia del genoma completo, ni más ni menos!! 3. Las células deben coordinar división celular con crecimiento de forma que las células mantengan su tamaño 4. En organismos pluricelulares la división celular solo debe ocurrir cuando se necesite. El control se produce en dos fases: a. Temporal: los eventos deben ocurrir en el momento adecuado.

b. Espacial: la distribución del huso mitótico en células epiteliales provoca la diferente separación en dos células hijas).

Para el estudio del ciclo celular se utilizan las levaduras S. cerevisiae y S. Pombe. Buscamos para ello mutantes TS, que presentan fenotipos mutantes a temperaturas restrictivas, pero que tiene un crecimiento similar al WT en condiciones normales. Una de las proteínas que tiene un papel muy importante en el ciclo celular es MPF (Maduration Promoter Factor). Se trata de una proteína heterodimérica compuesta por ciclina B o ciclina A y una quinasa dependiente de ciclina CDK-1 (también conocida como cdc-2 o quinasa p34). MPF promueve la entrada en mitosis desde la fase G2 mediante la fosforilación de múltiples proteínas requeridas durante la mitosis. Por ello, MPF es activado al final de la fase G2 gracias a la acción de una fosfatasa, que quita el grupo fosfato inhibitorio unido previamente al complejo. Así, MPF está compuesto de dos subunidades: -

Una subunidad que transfiere grupos fosfatos desde el ATP a residuos de serina o treonina de proteínas específicas (actividad quinasa).

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Ciclina, actividad regulatoria.

Las dianas de MPF incluyen:     

Condensinas, que permiten la condensación de la cromatina. Proteínas de unión a microtúbulos, involucradas en la formación del huso mitótico. Lamininas, cuya interacción contribuye a la degradación de la envuelta nuclear. Histonas H1 and H3. Matriz del aparato de Golgi, causando su fragmentación.

Se realiza un experimento revolucionario: se estudia la complementación de un mutante cdc- de levaduras con un gen humano. Este experimento demostró que el control del ciclo celular era universal (se descubre que la proteína cdc- 2/cdk se encuentra conservada). Todos los organismos eucariotas regulan el ciclo celular con las mismas moléculas.

El complejo cdc2- ciclina (MPF) regula para la progresión del ciclo celular, tanto la entrada en mitosis como en meiosis. Cdc2 se conserva a lo largo del árbol filogenético (mantiene casi por completo su estructura primaria) - Levaduras (Solo una kinasa, capaz de tomar y regular todas las decisiones del ciclo). - Drosophila (3 kinasas reguladoras del ciclo). - Humanos (4 kinasas se encuentran regulando el ciclo celular). En células animales hay 9 complejos CDK-ciclina: CDK2, CDK4, CDK6: control del ciclo celular. CDK7: es una kinasa que activa otras CDKs (CAK). CDK7, CDK8, CDK9: transcripción RNA pol II. CDK5: diferenciación células nerviosas. La activación del complejo MPF requiere fosforilaciones. La regulación de este complejo se lleva a cabo a través del control de los niveles de ciclina del medio, ya que las cdk no se degradan. Además, las ciclinas presentan una mayor diversificación a lo largo del árbol filogenético. (En levaduras es posible que la célula realice el ciclo celular únicamente con la ciclina mitótica) A y B presentan unas secuencias conservadas llamadas “destruction Bowls(¿?)” que envían a las ciclinas directamente al proteosoma al final de la mitosis (dominio de ubiquitinación).Se activa para ello APC (anafase promoter factor), una vez que los cromosomas han segregado correctamente. Es necesario un aumento en los niveles de ciclinas para que la célula entre en mitosis, de la misma manera que los niveles tienen que disminuir para que la célula pueda llevar a cabo de la citocinesis. Se conoce como modelo cuantitativo, ya que el desarrollo del ciclo celular dependerá de la [ciclinas] de interior celular. Al igual que las secuencias de degradación, también tiene mucha importancia en ciclinas las secuencias de reconocimiento de sustrato. La función de las ciclinas es: - Activadores de CDKs - Reconocer al sustrato (modelo cuantitativo) - Localización subcelular (recluta a quinasas).

v

Acti idad quinasa moderada (se inactivan las ciclinas). No es capaz de entrar en mitosis y repite la fase S una y otra vez.

Cdc 0 ausente (Factor de transcripción). Acumula la actividad quinasa, no pudiendo duplicar su material genético. Llega a mitosis directamente, MITOSIS LETAL. 1

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En condiciones normales, la actividad quinasa en G2 inhibe la entrada en fase S y favorece la entrada en mitosis.

Existen algunos complejos CDK-ciclina que presentan un tercer elemento. Así se permite seguir fosforilando elementos que ya presentan un elevado nivel de fosforilación (dificultad de acercar la molécula al complejo, por presentar una carga negativa tan grande).

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Regulación ciclinas.

La regulación local de las ciclinas se realiza teniendo en cuenta su localización subcelular: - Vertebrados: B1: citoplasmas, núcleo. B2: Golgi (se encarga de su fragmentación). - Levaduras: orígenes de replicación (Para que dupliquen el DNA). La activación temporal de CDK se regula por fosforilación y defosforilación mediante la acción de una kinasa Wee1 y una fosfatasa Cdc25. Esta fosforilación ocurre en tyr15 en levaduras y también en thr14 en células animales. Cdc25 y Wee permite detectar daños en el DNA y paliarlos. La actividad Cdk se suprime durante G1 en la mayoría de células que están proliferando activamente. Esto ocurre mediante tres mecanismos 1. Disminución de la expresión de las ciclinas 2. Destrucción de ciclinas 3. Inhibición de la actividad CDK mediante CKIs (disminuyen la actividad quinasa. Moléculas que “abrazan” al complejo e impiden su funcionamiento). -condiciones nutricionales, citokinas, etc. -daño DNA INK: pequeñas moléculas. Su actividad inhibitoria sigue el siguiente mecanismo: rota ligeramente a la quinasa de manera que puede formar complejo con su ciclina.

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Ciclo celular en células animales.

En él interviene varios complejos ciclinas-cks. La síntesis y destrucción temporal de las ciclinas regula la progresión del ciclo celular.

Control de la citocinesis: Debe haber tensión en los cinetocoros de las cromátidas(Es síntoma de que los cinetocoros han sido capturados, por lo que aumenta los niveles de APG, para que se degraden las ciclinas). Si el huso mitótico no ha capturado bien los cromosomas, o no hay tensión, se activa un checkpoint que le da más tiempo a la célula a arreglar ese problema. Si no se repara, se activa la apoptosis. [Drogas anti cancerígenas actúan sobre los microtúbulos en este paso, haciendo a los microtúbulos más estables]. Existen varios PUNTOS DE CONTROL o CHECKPOINTS a lo largo del ciclo celular: - Start: la célula decide si entra en el ciclo celular o no, dependiendo de o La [nutrientes] o Contacto célula-célula o Citoquinas - G2- M: antes de entrar en mitosis. Se asegura que los cromosomas estén bien replicados. - Metafase-anafase: Cromosomas correctamente capturados por la placa metafásica.

Para estudiar qué moléculas actúan en estos puntos de regulación, estudiamos la cinética de regulación de cdc25 y su distribución en los núcleos. [CDC25 es un activador del complejo ciclina-quinasa]. Cuando se daña el DNA mediante irradiación, cdc25 se secuestra en el citoplasma. (Se produce una ruptura de la doble hélice).

Chk1 avisa a cdc25 para que no entre en el núcleo (Mutantes de Chk1 hacen que cdc25 siempre entran en el núcleo). Chk1 fosforila a cdc25 en un residuo de serina, lo que provoca la unión de la proteína 143-3 que impide su entrada en el núcleo. Además, Chk1 fosforila a Wee1, activando su actividad quinasa. La activación de Wee1, provoca la inactivación del complejo cdc-ciclina, retrasando la entrada en mitosis.

La proteína 143-3 unida a Wee1 no es secuestrada en el citoplasma.

El tiempo que tarda en acumularse la actividad cdc2-ciclina es el tiempo que tarda la célula en entrar en mitosis. Si se inhibe la actividad quinasa cdc2-ciclina, se tarda más tiempo en entrar en mitosis.

- G1-S CHECKPOINT. En células animales tiene mucho más peso este checkpoint.

Si p53 está mutado: en la célula se acumulan mutaciones, es ciega a los daños del DNA. Sin embargo el ciclo celular es robusto. Se necesitan mutaciones en varios de estos genes que interviene en el control del ciclo. Así existen varios tipos de mutaciones: - Inactivación: da igual, porque tenemos dos cromosomas iguales, por lo que uno suple la deficiencia del otro. - Excesiva activación: más difícil de controlar. - TGF- β: cuando las células están muy juntas y apretadas, p27 se activa y se inhibe la división celular. Las sospechas acerca del origen del proceso oncogénico en humanos afectan primeramente al checkpoint de G1.La interrupción del checkpoint causa un incremento en la tasa de mutaciones, de las que muchas de ellas acabaran acarreando. Muchos de las cepas de virus que contiene DNa canceroso tiee funciones que perjudican las funciones de p53 o RB. Mutágenos naturales y químicos, los principales causantes de la oncogénesis humana, también mutan al gen p53. -

G2 CHECKPOINT

La deficiencia del checkpoint del huso mitótico puede tener serios consecuencias en la progresión de un tumor. Al añadir droga (carbenzamida) que

impide la formación de microtúbulos, la célula no puede hacer mitosis, queda atrapado en 4c y hace apoptosis. -

HUSO MITÓTICO

Estructura formada por microtúbulos. Aparece durante el proceso de mitosis y se encarga de capturar los cinetocoros de los centrosomas y de llevarlos hasta la placa ecuatorial. El huso se organiza a partir del centrosoma, que en células animales está formado por dos centriolos. Los centriolos tienen que duplicarse durante la división celular, ya que estos se repartirán entre las células hijas. Durante la mitosis se reparten los cromosomas duplicados durante la fase S entre las dos células hijas. La segregación de los cromosomas la realiza el huso Mitótico, un dispositivo molecular que tira de las cromátidas hacia cada polo de la célula. Una célula sin centrosoma, está viva pero es torpe. Es decir, en ausencia de centrosoma, la direccionalidad de las células se ve afectada. Por eso, las neuronas sin centrosomas son deficientes, y el proceso de neurogénesis se ve perjudicado. (Moscas pueden vivir sin centriolos). Los microtúbulos nacen de los centrosomas (extremo -) y se extienden a lo largo de la célula (extremo +). Hay moléculas motoras que unen unos microtúbulos con otros (dineínas y kinesinas) Existen distintos tipo de microtúbulos: - Cinetocóricos: atrapan a los cromosomas - Interpolares o solapantes: solapan unos con otros en el centro de la célula gracias a la acción de moléculas motoras que actúan como lazo de unión. (La zona de unión de estos microtúbulos determinará la zona de división de la célula. Se consigue así una gran variedad de tipos de división). - Astrales: forma de estrellas. Su función es la de leer la geometría de la célula.; de manera que pude dirigir a los microtúbulos en un eje. (las células necesitan dividirse con una determinada simetría). EJEMPLO: C. elegans se dividen de forma asimétrica, por la existencia de una preferencia de estos microtúbulos por uno de los extremos. Mecanismos de ensamblaje - Autoensamblaje: mediada por moléculas motoras. Las dineínas unidas en los extremos +; y las kinesinas unidas en los extremos -. Esta es la razón por la cual Drosophila es capaz de vivir sin centrosomas. En las neuronas distintos tipos de microtúbulos son reconocidos por distintos tipos de moléculas motoras, de manera que pueden transportar distintas moléculas hacia los axones. Así, cada vesícula con distinta carga, son dirigidos específicamente. - Mediado por los centrosomas. Los extremos + de los microtúbulos son mucho más dinámicos que los extremos-. La adición y eliminación de subunidades de tubulina ocurre normalmente en los extremos +, pero en células animales los extremos – de los microtúbulos son también dinámicos. Los microtúbulos son unas estructuras dinámicas. El dinamismo de estos se cono ce como INESTABILIDAD DINÁMICA, que supone la alternancia entre polimerización (adición de subunidades de tubulina), catástrofe (eliminación de subunidades de tubulina) y pausa: Ni una cosa ni la otra. Los microtúbulos están formados por subunidades α y β que se ensambla para formar dicha estructura. Estas subunidades, antes de polimerizar, tienen unido GTP. Este se mantiene al unirse en el extremo, pero se hidroliza en el momento en que otra subunidad se une. Si la última subunidad se une, y pasa un rato sin que se produzca una nueva unión, El GTP se hidroliza a GDP. Esto produce un cambio conformacional que, si ocurre en el medio del microtúbulo no tiene consecuencias; pero si ocurre en el extremo, la dinámica pasa de polimeralización a despolimeralización. En

el

extremo – se sitúa un complejo de gamma

tubulina. Actúa como punto de polimeralización del microtúbulo, presentando la estructura de molde en forma de hélice. Existen polimerasa que se encargan del crecimiento de los microtúbulos. Un ejemplo de ellas es MAP215. Al marcarla con GFP vemos que se sitúa en los extremos de crecimiento de los microtúbulos, alejándose de la base de los mismos a medida que pasa el tiempo. Esta proteína captura las subunidades de tubulina y las une progresivamente al extremo del microtúbulo.

De la misma manera, existen algunas proteínas que se encargan de desestabilizar el microtúbulos, ejerciendo torsiones sobre la estructura de los mismos (MCAK). -

Ensamblaje y arquitectura del huso.

Las proteínas motoras son responsables de ambas acciones. Así: -

Kinesina 5 (extremo +). Kinesina 14 (extremo -). Kinesina 4, 10 (extremo +; cromokinesinas). Dineina (extremo -, posicionando así el huso mitótico haciendo interaccionar todos los extremos -).

Las kinesinas precisas de ATP para moverse sobre los microtúbulos, y al hacerlo los desplazan. La fuerza generada por la polimerización-despolimerización de los microtúbulos y por proteínas motoras pueden mover estructuras. Los microtúbulos están sometidos a fuerzas Brownianas, de manera que vibran. Si la vibración del microtúbulo es mayor que el dímero de tubulina, se produce polimeralización, aunque la estructura se encuentre con barreras, lo que genera fuerzas mecánicas que generan el desplazamiento del microtúbulo. -

Microtúbulos en mitosis.

Los microtúbulos tienen un papel muy importante dentro de la miosis, ya que interaccionan con los cinetocoros para segregar a los cromosomas. Los cinetocoros son estructuras proteicas que unen ambas cromátidas hermanas en los cromosomas, y son el puto de unión de los microtúbulos del huso.

Los cinetocoros inician, controlan y supervisan los llamativos movimientos de los cromosomas durante la división celular. En cuanto a su estructura, los cinetocoros de las células animales pueden subdividirse en dos regiones: 



El cinetocoro interno se organiza normalmente sobre secuencias de ADN altamente repetido (el ADN satélite) y se ensambla en una forma especializada de cromatina que persiste a través del ciclo celular. El cinetocoro externo es una estructura proteica con muchos componentes dinámicos que se ensambla y funciona sólo durante la división celular.

Las funciones del cinetocoro incluyen el anclaje de los cromosomas a los MTs del huso mitótico, la verificación de esos anclajes, la activación del checkpoint de mitosis (un mecanismo de control que retrasa la salida de mitosis si se detectan fallos) y la participación en la generación de las fuerzas que propulsan los movimientos cromosómicos durante la división celular.

La unión del

microtúbulo al cinetocoro está mediada por el anillo representado en el dibujo anterior. En torno a los cinetocoros hay una intensa actividad nucleadora de microtúbulos, de manera que contamos con una actividad más para formar el huso mitótico. Los cromosomas se sitúan en la placa metafásica gracias a la acción de moléculas motoras que los apuran y desplazan. El microtúbulo, una vez ha capturado al cinetocoro, despolimeriza y va abriéndose; de manera que desplaza el anillo, arrastrando con ella as cromátidas cada una a un polo de la célula. El dinamismo de los microtúbulos durante las distintas fases de la mitosis va variando. De esta manera, tendremos que:

-

Se pierde tubulina por el extremo – y se añaden en el extremo +. Se mantienen los cromosomas en el centro de o placa ecuatorial. METAFASE. Cambio de la dinámica. Para separar los cromosomas en la ANAFASE se produce despolimeralización por ambos extremos.

Modelos matemáticos predicen que si el sistema mitótico funcionara de manera aleatoria, el proceso duraría al menos una semana. Por ello todas las actividades y funciones quedan muy bien definidas. En el momento ...