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Apuntes de Microbiología...

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Carolina Campos Grado de Biotecnologí a

El metabolismo es la estrategia que tienen las bacterias para transformar las moléculas externas en energía. -

Metabolismo todas aquellas reacciones químicas mediadas por enzimas en el citoplasma. Catabolismo generación de energía. Son reacciones oxidativas, donde las moléculas con un elevado potencial negativo se van oxidando a un potencial mas negativo. Anabolismo formación de biomoléculas. Se emplea la energía generada.

1. CLASIFICACIÓN DE LOS ORGANISMOS SEGÚN LA FUENTE DE ENERGIA Y DE CARBONO EN SU METABOLISMO En cuanto a la necesidad de la fuente de energía y la fuente de carbono podemos clasificar los microorganismos en 4 categorías. Los organismos más independientes son los fotoautótrofos donde la fuente de energía externa es amienta, energía electromagnética del espectro visible y si le asociamos una partícula a esta energía hablaremos de fotones (luz). Estos organismos utilizan la luz para la fotosíntesis y así realizar reacciones anabólicas para la obtención de biomoléculas. Un ejemplo de un fotoautótrofo son las plantas y las algas. Dentro de lo microbiológico encontraremos las bacterias fotosintéticas y las arqueas fotosintéticas. Los hongos no contienen cloroplastos por lo que no pueden realizar la fotosíntesis, por lo que no son fotoautótrofos. En cuanto a la fuente de carbono, generan su propia comida. La fuente de carbono para construir las biomoléculas es el dióxido de carbono. Los organismos quimioheterótrofos, tienen como fuente de energía moléculas orgánicas, mayoritariamente polisacáridos, es la energía externa que convertimos en ATP. También podemos usar los lípidos como fuente de energía externa. Y las proteínas, los aminoácidos se pueden usar como fuente alternativa de energía, y no hay que oxidarlos tanto como los lípidos. En este grupo encontramos todos los animales, hongos y bacterias gramnegativas como E. coli o alguna grampositivas como L. casei. o S. aureus, modelo de pared en las grampositivas. La mayoría de bacterias biotecnológicas o patógenas son quimioheterótrofas. Hay también alguna arquea pero son pocas. Aquí también hay que sumar la mayoría de protozoos. Los quimiautótrofos o quimiolitótrofos (litos=piedra). Mayoritariamente son bacterias y arqueas. Fueron primariamente halladas en zonas donde los minerales era muy abundantes, como la pirita. Estas bacterias i arqueas fueron recuperadas de minas con agua, donde podía obtener energía arrancando electrones de iones parcialmente reducidos (hierro 3+ o hierro 2+, de sulfitos a sulfatos). Tienen una aplicación biotecnológica importante, la biolixidación: recuperación de cobre mezclado con sulfitos, gracias al uso de estas bacterias. La fuente de carbono es el CO2.

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2. ENERGIA QUÍMICA INTERNA UNIVERSAL: EL ATP El ATP es el adenosín trifosfato. Este contenido en la unión de dos grupos fosfatos. Por cada mol de ATP que se hidroliza, se liberan 7,3 kilocalorías en condiciones fisiológicas. El ADP a nivel fisiológico cas nunca se hidroliza, por lo que siempre veremos reacciones que requieren de energía mediante la hidrolisis del ATP. Todos los organismos quimio heterótrofos realizan una serie de reacciones comunes: -

Glicólisis Ciclo de Krebs  serie secuencial de reacciones enzimáticas. La cadena respiratoria  no todos los organismos contienen los citocromos que permiten realizar las reacciones de la cadena respiratoria, como Lactobacillos bulgaricus, a pesar de que cuando hacemos yogurt está expuesta al oxígeno, no lo usa para nada.

3. VÍA GLUCOLÍTICA (RUTA DE EMDEN-MEYERHOFF) La primera reacción es un mecanismo de transporte activo: transformación de glucosa extracelular en glucosa-6-fsfato intracelular, el fosfato se obtiene del ATP dentro del citoplasma. De glucosa 6-fofato obtenemos fructosa 1,6-dfosfato. De aquí obtendremos dihidroxiactetona fosfato que se convierte en glicerlahdehido 3-fosfato (2 por cada molécula de glucosa). Pasamos a ácidos 2,3-difosfoglicérico, proceso en el que la molécula se ha oxidado, mediante el 2NADH, uno por cada ácido 2,3-difosfoglicérico. Pasa a ácido 3.fosfoglicérico y le entrega el fosfato a un ADP generando 2 ATP. Este se isomeriza a ácido 2-fosfoglicerico que da lugar al ácido fosfo-enol-pirúvico. Este le entrega un fosfato al ATP generando 2 ATP. La molécula final es el ácido pirúvico, dos por cada molécula de glucosa. Existen bacterias que no tienen cadena de transporte electrónico, por lo que utilizan el ácido pirúvico de la glucolisis para la obtención de ATP mediante fermentaciones. Este ácido pirúvico lo transforma en ácido láctico, este se reduce. El poder reductor lo saco del NADH usado en la glucólisis y se transformará en NAD+ para nuevamente entrara a jugar en este ciclo de reacciones de la glucolisis. En la vía glucolítica de estas bacterias pueden entrará otros monosacáridos, como la fructosa que se transforma en fructosa 6-fosfato, directamente. Más moléculas como la lactosa u otras pentosas o el glicerol, pueden hidrolizarse e isomerizarse para entrar en otros puntos de la vía glucolítica y terminar igual que la glucosa. Esta que acabamos de describir es la fermentación láctica (ácido monoláctico como resultado de la fermentación).

3.1. RUTA DE ETNER-DUODUROFF En la ruta de Etner-Duodoroff es una ruta alternativa poco extendida en la naturaleza, se sigue la misma vía que antes, pero el ácido pirúvico se trasforma en una molécula de etanol y el gliceraldheido 3-fosfato también generará poder reductor y ATP, generando como molécula final el etanol. Esta fermentación es la alcohólica, que la pueden utilizar microorganismos como, pseudomonas, rhizobium, xhantomonas, axotobacter y zynomonas.

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4. LA FERMENTACIÓN Hay organismos incapaces de sintetizar estos citocromos o que por condiciones ambientales inhiben la respiración a pesar de que haya citocromos: la respiración anaeróbica, como en S. cerevisiae. En el caso de que la bacteria se encuentre en un medio con poco oxígeno, no tendría donador de electrones para el final de la cadena de transporte electrónico, por lo que activan el mecanismo de la fermentación. Bacterias de interés biotecnológico: Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, que realizan fermentaciones. Existen otros tipos de fermentaciones, como la fermentación propiónica. Desde un punto biotecnológico, el queso emmental se caracteriza por los grandes agujeros que tiene. En la fermentación de estos quesos, no solo participan bacterias acidolácticas,también propiónicas. La fermentación propiónica genera ácido propiónico a partir del priúvico. Durante el proceso se generan CO2 causante de los agujeros de ese queso. No se puede exceder el uso de estas bacterias ya que el exceso de ácido propiónico no huele bien. Otro tipo de fermentación es la que realizan el género Clostrídium, generadores de la toxina botulínica (botox). Es la fermentación butírica, que generan el ácido butírico o butanol. Son bacterias con forma de bacilos, como las especies de género Salmonella o Escherichia que pertenecen a la família Entereobacteriaceae que realizan la fermentación ácido mixta, generando etanol, ácido láctico, ácido succínico, ácido acético, CO2 y H20. Finalmente el Enterobacter que genera etanol y ácido láctico. Como puedo conocer el metabolismo de una bacteria? El nombre que le damos a los medios de cultivo líquidos, es el de caldo, donde podré añadir diferentes fuentes de carbono y nitrógeno, suficiente para que puedan crecer y reproducirse las bacterias. Dentro hay un tubo invertido llamado campana Durham. Yo puedo inocular glucosa con Staphilococus aureus, lo pongo a una temperatura adecuada y al día siguiente encuentro el tubo de un color diferente y si sigo con la incubación encontrare el ultimo tubo. De esta manera pongo en evidencia su metabolismo energético, con el tubo demuestro que ha producido CO2 y con el cambio de color que ha cambiado el pH dele medio de cultivo. El tubito nos puede orientar al tipo de metabolismo que tiene la bacteria. Las bacterias acidolácticas es un grupo filogénicamente bastante coherente, grampositivas. En cuanto a morfología tenemos desde cocos a bacilos. En cuanto a las fermentaciones que realizan: Fermentación homoláctica, donde el último producto de la fermentación es únicamente el ácido láctico. Dentro de este grupo de bacterias están las de Lactobacillus que realizan la fermentación heteroláctica. Producen como producto final el ácido láctico y algunos otros productos, ya que la vía glucolítica tiene unas pequeñas variaciones durante su trayecto. Estas bacterias producen pequeñas cantidades de CO2 y C. Estas bacterias que hacen heterofermentación o fermentaciones heterolácticas son las responsables de los agujeritos de los quesos. Esto puede suponer una desventaja para la industria alimentaria, por lo que se decide normalmente no trabajar con este tipo de bacterias, ya que el etanos o ácido acético pueden ser perjudiciales. Oras bacterias como Leuconostoc a partir de azúcares sencillos pueden producir polisacáridos que expulsan 3

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hacia afuera cosa que le puede dar un aspecto pringoso o viscoso al producto alimentario, por lo que no es muy agradable y no se comercializa, aunque no sea perjudicial para la salud. Existen vinos o variedades de cava se producen mediante la fermentación malo-láctica. El zumo de la uva contiene una gran cantidad de ácidos fermentados, acidez fija debida a una cantidad importante de ácidos orgánicos, en el caso de la uva de ácidos málicos. Normalmente los vinos tintos no toleran estos grados de acidez, ya que modifican el pH (bastante ácido). Alguanas bacterias de las ácido lácticas son capaces de realizar este tipo de fermentación la maloláctica, y transformar el ácido láctico en maloláctico y perder un grupo carboxilo, cosa que implica que el grado de acidez de ese mosto fermentado aumente, ya que al fin y al cabo se pierde un grupo ácido, normalmente de un pH de 4 al de 6, cosa que es mucho más agradable al paladar. Esto implica un bombamiento de protones al espacio extracelular y por lo tanto cuando entra, genera la síntesis de ATP. Explota parte del sistema de generación de energía ligado a la cadena respiratoria, no usa citocromos pero si usa la ATP sintasa. Encontramos también la fermentación acética. Tampoco es una fermentación como tal, realmente es un proceso oxidativo que depende directamente de la cadena respiratoria. Se produce la oxidación de un etanol a actaldehido y este para obtener ácido acético. La molécula que se reduce (poder reductor) es el NADH, de la cadena respiratoria de la mitocondria. En este caso es una cadena respiratoria oxigénica o aeróbia, de manera que se genera ATP, por lo tanto se trata de un sistema anexo a la cadena respiratorio, es por eso que no es estrictamente correcto llamarlo fermentación.

4. EL CICLO DE KREBS El Ciclo de Krebs es un ciclo de oxcidación del Acetil-CoA, que genera 3 NADH 2FADH2 y 2GTP, que proviene de la vía glucolítica (oxidación del piruvato). Las moléculas que obtenemos son CO2 y H20. Las moléculas de poder reductor FADH2 y NADH transportan los electrones a la cadena respiratoria y de nuevo por el gradiente electroquímico que genera su transporte se bombean protones y se forma ATP. La manera que tengo de sacar estos electrones que han ido perdiendo energía, es a través de una molécula aceptora de electrones, en este caso es el Oxígeno y forma finalmente una molécula de H2O.

5. LA RESPIRACIÓN ANAERÓBIA Existe algún otro aceptor de electrones de la cadena respiratoria, es decir, anaerobia? Vendría a ser otro compuesto altamente oxidado que sea capaz de reducirse fácilmente, y no tiene que ver nada con la fermentación. Que comparten respiración anaerobia y la fermentación? Comparten la glucólisis. En el laboratorio tenemos una prueba que consisten en unas tiras reactivas que me evidencian si la bacteria tiene citocromo oxidasa de la cadena respiratoria, cosa que me dará una reacción coloreada de violeta. Por qué puede ser esto importante? Puede ser importante ya que me puede ayudar a determinar de qué bacteria se trata. CUIDADO: E. coli es capaz de hacer respiración anaerobia, respiración aerobia y fermentación.

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Cuando tenemos una respiración anaerobia generalmente el aceptor final de electrones es el Nitrógeno o el azufre. Evidentemente para ello necesitamos presenciar el Nitrógeno en forma de nitrato que no está presente en nuestro organismo, y tenemos que incorporarlo con los alimentos que tomamos. El nitrato se reduce a nitrito, que como ión es muy reactivo con proteínas del grupo hemo ya que forma un compuesto muy muy estable, cosa que le da al embutido un color rosado muy bonito que le da la sensación de producto fresco. El nitrtio se une donde debería unirse el oxígeno, por lo que ya no permite el transporte de este. Este mecanismo e un mecanismo suicida también para E. coli, ya que las proteínas hemo también con importantes para su metabolismo, por lo tanto estas proteínas hagan la función que hagan pierden su funcionalidad. Existen bacterias que solo hacen oxidaciones por lo tanto solo pueden hacer respiraciones aerobias o anerobias, y transforman el nitrito en nitrato y este en nitrógeno atmosférico. En su caso este mecanismo no es un mecanismo suicida sino que es un mecanismo eficiente. Existen bacterias que transforman el acetato en ácido sulfúrico, y algunas arqueas capaces de usar el bicarbonato y transformarlo en metano, por lo que reciben el nombre de metanógenas y les gusta crecer en medios ácidos.

6. QUIMIOLITOTRÓFIA Algunas de las bacterias quimiolittotrofias se pueden encontrar en el suelo o contaminando las aguas con sus productos finales de sus fermentaciones y procesos metabólicos. Frecuentemente en el suelo encontramos Thiobacillus. En el caso del azufre, utiliza un mecanismo alternativo, cuyo objetivo es obtener electrones que se trasfieren a unos citocromos, se pueden obtener del ácido sulfhídrico o sulfuros metálicos. También se pueden encontrar en minas con ausencia de oxígeno, donde no solo proliferan estos Thiobacillus, sino también las bacterias que usen el azufre como aceptor final de electrones. Estos modelos se presentan como modelos de bacterias que pueden sobrevivir en el espacio.

7. CATABOLISMO PROTEICO Los aminoácidos que provienen dela hidrólisis de las proteínas se pueden someter a procesos de oxidación y transformarlos en ácidos orgánicos que se introducen directamente en el ciclo de Krebs. Si los aas transformados, desaminados, descarboxilados, deshidrogenados, pueden ser el origen básico para biosintetizar algunos aminoácidos.

7.1. RUTAS AMFIBÓLICAS El Ciclo de Krebs no solo sirve como vía catabólica, en el caso de que haya un exceso de glucosa, el ciclo de Krebs participara como ruta anabólica para la biosíntesis de algunos de los aas esenciales. Por lo tanto en realidad la vía glucolítica y el ciclo de Krebs funcionan en ambos sentidos, cuando tengo una cantidad importante de un determinado monosacárido puedo usar el ATP generado mediante estas vías para anabolizar otros compuestos. Se llaman vías o rutas amfibólicas.

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8. FUNTES DE NUTIENTES PARA LA FORMACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO Con esto se puede formular un medio de cultivo básico y sintético (conozco la composición quantitativa y qualitativa de ese medio) que soporte el crecimiento de organismos a partir de una fuente de energía básica y los elementos necesarios para construir las biomoléculas. Existen metales que actúan como cofactores de enzimas. Estos metales como el calcio o magnesio no precipitan se forman quelatos que son hidrosolubles. En este medio de cultivo así diseñado (con más fuentes de elementos pero míralo en la diapo) es mínimo porque asumo que a partir de esto mi organismo es capaz de formar todas las biomoléculas que el necesite, realmente no hay vitaminas no hay lípidos no hay aas, no hay moléculas más complejas que la glucosa, por lo que tengo que asumir que el resto de moléculas las puede sintetizar él solo. Este medio tiene que ser líquido, es decir, un caldo. En oposición al medio líquido completamente fluido necesitamos algo sólido, una gelatina. Ese medio es algo parecido una gelatina, es un gel por definición. Que se suele usar para estos medios? El AGAR, un polisacárido que se saca de las algas.

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