Taller Grupal DE Enzimas Catalasa Y Ureasa Final PDF

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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LABORATORIO DE BIOQUIMICA I SEGUNDO PARCIAL TALLER GRUPAL: PRACTICA #1: ACTIVIDAD DE LA ENZIMA CATALASA EN DIVERSOS TEJIDOS PRACTICA #2: EXTRACCION DE LA ENZIMA UREASA Y DEMOSTRACCION DE SU ACCION CATALITICA

AUTORES: FRANCO BRAVO GUSTAVO REYES SOSA YAHAIRA RAMON OCHOA SANDY CARRIEL ANGIE FECHA: 18/07/2017 GRUPO: G1-B DOCENTE: QF. NILDA CEDEÑO Msc. CICLO: 2017 – 2018

Práctica #1 1. Título: Actividad de la enzima catalasa en diversos tejidos 2. Objetivos generales: 

Verificar la actividad enzimática de la catalasa en diferentes tejidos, ya sean tejidos animales (hígado de pollo) o tejidos vegetales (papa y manzana), mediante la aplicación de diferentes reactivos y la presencia de factores tales como el PH y la temperatura.

3. Objetivos específicos: 

Analizar la actividad catalítica de la catalasa, frente al agua oxigenada, al ácido clorhídrico 0,5 N, al cloruro de mercurio y por efecto de temperatura.



Observar los cambios producidos dentro del tubo de ensayo (efervescencia, precipitado, colores, fases).

4. Aspecto teórico: Nombre sistemático: Peróxido de hidrógeno peroxidasa. Estructura química de la catalasa La catalasa es una proteína tetramérica que se encuentra en los organismos vivos que contiene hierro férrico y que viene por codificada por un gen situado en el cromosoma 11p13. Consta de 34 kb y contiene 12 intrones y 13 exones. Estructura espacial:

Información técnica y genética de la catalasa

Actividad enzimática de la catalasa

La catalasa es una enzima perteneciente a la categoría de las oxidorreductasas que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno (H202) en oxígeno y agua. Esta enzima utiliza como cofactor al grupo hemo y al manganeso.

El mecanismo completo de la catalasa no se conoce, aun así, la reacción química se produce en dos etapas:

Donde Fe-E representa el núcleo de hierro del grupo hemo unido a la enzima que actúan como cofactores. La enzima se presenta en forma de homotetrámero y se localiza en los peroxisomas. Esta enzima puede actuar como una peroxidasa para muchas sustancias orgánicas, especialmente para el etanol que actúa como donante de hidrógeno. Las enzimas de muchos microorganismos, como el Penicillium simplicissimum, que exhiben actividad de catalasa y peroxidasa, son frecuentemente llamadas catalasasperoxidasas. La catalasa es una enzima presente en los peroxisomas de las células de todos los tejidos animales y vegetales. Actúa sobre el peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) descomponiéndolo en agua y oxígeno, y liberando energía en forma de calor. El agua oxigenada es un producto resultante de las reacciones metabólicas y si no se destruye puede ser tóxica para la célula. Si se pone un tejido en contacto con el agua oxigenada se observa la aparición de efervescencia (producción de oxígeno). El peróxido de hidrógeno es un residuo del metabolismo celular de muchos organismos vivos y tiene entre otras, una función protectora contra microorganismos patógenos, principalmente anaerobios, pero dada su toxicidad debe transformarse rápidamente en compuestos menos peligrosos.

Esta función la efectúa esta enzima que cataliza su descomposición en agua y oxígeno. Además, la catalasa se usa en la industria textil para la eliminación del peróxido de hidrógeno, así como en menor medida se emplea en la limpieza de lentes de contacto que se han esterilizado en una solución de peróxido de hidrógeno. La determinación de presencia o ausencia de catalasa resulta útil en el área de bacteriología, para diferenciar colonias de estreptococos, que son catalasa negativos, de estafilococos o micrococos, que son bacterias que contienen catalasa. También se utiliza para diferenciar los géneros Bacillus (catalasa positiva) de Clostridium (catalasa negativa). Para realizar la prueba de la catalasa, se toma una colonia aislada del cultivo bacteriano y se coloca sobre un portaobjetos. Sobre ella se deja caer una gota de peróxido de hidrógeno. Si el resultado es positivo, se observará la formación de burbujas. La ausencia congénita de catalasa es causante de una acatalasemia (o acatalasia), la enfermedad de Takahara que se manifiesta por la ausencia de actividad de la catalasa en los glóbulos rojos y con severas infecciones gangrenosas de la boca, pudiendo producir la pérdida de los dientes y graves destrucciones de los maxilares y regiones blandas que los cubre, esta es una enfermedad congénita del Japón (2 de 100.000 habitantes sufren de este trastorno). Si el cultivo bacteriano fue realizado en agar sangre, hay que tener precaución de no llevar un trozo de agar con el asa cuando se levanta la colonia, porque de esta manera se pueden dar resultados falso-positivos. Función y localización de la catalasa La catalasa es una proteína tetramérica que viene por codificada por un gen situado en el cromosoma 11p13. La función más importante de la catalasa es convertir el peróxido de oxígeno en agua y oxígeno, pero también utiliza el peróxido de oxígeno para catalizar reacciones de peroxidación. Forma parte de un conjunto de enzimas antioxidantes entre las que se encuentran

el superóxido-dismutasa y las peroxidasas, cuya función es proteger a los tejidos de las especies oxigenadas reactivas producidas por los neutrófilos. En particular, la catalasa protege la hemoglobina y probablemente el ADN frente a la peroxidación. Estable y rápida La molécula de catalasa es muy estable. Esta estabilidad es necesaria ya que la enzima tiene que trabajar para romper reactivos químicos dentro de la célula de forma rápida y eficiente. Si fuera inestable, estas moléculas reactivas serían capaces de descomponerla y causar daño a la célula. La enzima se compone de cuatro subunidades idénticas a las que se pueden unir otras moléculas. En la célula, cada molécula de catalasa puede romper millones de moléculas de peróxido de hidrógeno en menos de un segundo. Forma La forma de la enzima catalasa es ligeramente diferente para cada tipo de célula. En los seres humanos, la catalasa utiliza iones de hierro para sujetar al peróxido de hidrógeno. Muchas bacterias pueden utilizar enzimas catalasa más grandes para atacar al peróxido de hidrógeno. Otras formas de bacterias utilizan iones de manganeso en lugar de los iones de hierro dentro de la célula. Usos La catalasa se ha estudiado ampliamente, ya que está presente en todos los organismos vivos. Esto ha llevado a que la enzima se utilice para muchos propósitos, como para eliminar el peróxido de hidrógeno a partir de la leche antes de que se procese en queso. También se puede encontrar en desinfectantes de lentes de contacto y está también en envolturas de alimentos para evitar la oxidación y mantener los alimentos frescos durante períodos más largos de tiempo. 5. Fundamento de la práctica:

La práctica consiste en observar la reacción enzimática de la catalasa en diferentes tejidos ya sean animales o vegetales, a los cuales se les va a agregar peróxido de hidrogeno, recordando que la catalasa descompone el H2O2 en hidrógeno y oxígeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que la prueba es positiva para la actividad enzimática de la catalasa. 6. Aparatos, instrumentos y reactivos utilizados: Aparatos e instrumentos  Balanza



Solución

Reactivos de hígado

de

pollo



Vaso de precipitado 250 mL

macerado y triturado (0,5g------>10



Reverbero

gotas)



15 tubos de ensayo



25g de papa



Espátula



25g de manzana



Pipetas de 5 y 10 mL



15 mL de Agua destilada



Gradillas



60 mL de Peróxido de hidrogeno



Auxiliar o pera

Reactivos

Agua oxigenada (H2O2)

(Agua oxigenada H2O2)

Pictog



10 mL de HCl al 5%



10 mL de NaOH al 5%



10 mL de Cl2Hg al 5% ases R y S

Ácido clorhídrico (HCl)

Hidróxido de sodio (NaOH)

Cloruro mercúrico (Cl2Hg)

7. Procedimiento: a) Actividad catalítica de la catalasa: 

Tubo de ensayo 1:  Agregar X gotas o 0,5 g de la solución de hígado de pollo macerado y triturado.

 Adicionar 2 mL de agua destilada.  Luego añadir 2 mL de agua oxigenada.  Finalmente mezclar, observar y anotar los resultados. 

Tubo de ensayo 2:    



Agregar 0,5 g de raspado del mesocarpio de la papa. Adicionar 2 mL de agua destilada. Luego añadir 2 mL de agua oxigenada. Finalmente mezclar, observar y anotar los resultados.

Tubo de ensayo 3:  Agregar 0,5 g de raspado de la pulpa o mesocarpio de la manzana.  Adicionar 2 mL de agua destilada.  Luego añadir 2 mL de agua oxigenada.  Finalmente mezclar, observar y anotar los resultados. Tubos Hígado (g)

1

2

3

0,5

Papa (g)

0,5

Manzana (g)

0,5

Agua destilada (mL)

2

2

2

H2O2 (mL)

2

2

2

b) Efecto de la temperatura: 

Tubo de ensayo 1:  Agregar X gotas o 0,5 g de la solución de hígado de pollo macerado y triturado.  Adicionar 2 mL de agua destilada.  Llevar a baño de agua hirviendo durante 5 minutos, retirar y enfriar.  Luego añadir 2 mL de agua oxigenada.  Finalmente mezclar, observar y anotar los resultados.



Tubo de ensayo 2:     



Agregar 0,5 g de raspado del mesocarpio de la papa. Adicionar 2 mL de agua destilada. Llevar a baño de agua hirviendo durante 5 min, retirar y enfriar. Luego añadir 2 mL de agua oxigenada. Finalmente mezclar, observar y anotar los resultados.

Tubo de ensayo 3:  Agregar 0,5 g de raspado de la pulpa o mesocarpio de la manzana.  Adicionar 2 mL de agua destilada.  Llevar a baño de agua hirviendo durante 5 min, retirar y enfriar.  Luego añadir 2 mL de agua oxigenada.  Finalmente mezclar, observar y anotar los resultados. Tubos Hígado (g)

1

2

0,5

Papa (g)

0,5

Manzana (g) Agua destilada (mL)

3

0,5 2

2

2

Baño de agua hirviendo durante 5 min, retirar y enfriar H2O2 (mL)

2

2

2

c) Efecto del Ácido clorhídrico 0,5 N: 

Tubo de ensayo 1:  Agregar X gotas o 0,5 g de la solución de hígado de pollo macerado y triturado.  Adicionar 2 mL de HCl al 5%.  Mezclar y dejar en reposo durante 10 min.  Luego añadir 2 mL de agua oxigenada.  Finalmente mezclar, observar y anotar los resultados.



Tubo de ensayo 2:     



Agregar 0,5 g de raspado del mesocarpio de la papa. Adicionar 2 mL de HCl al 5%. Mezclar y dejar en reposo durante 10 min. Luego añadir 2 mL de agua oxigenada. Finalmente mezclar, observar y anotar los resultados.

Tubo de ensayo 3:  Agregar 0,5 g de raspado de la pulpa o mesocarpio de la manzana.  Adicionar 2 mL de HCl al 5%.  Mezclar y dejar en reposo durante 10 min.  Luego añadir 2 mL de agua oxigenada.  Finalmente mezclar, observar y anotar los resultados. Tubos Hígado (g)

1

2

3

0,5

Papa (g)

0,5

Manzana (g) HCl al 5% (mL)

0,5 2

2

2

Mezclar y reposar por 10 min H2O2 (mL)

2

2

2

d) Efecto del NaOH 0,5 M: 

Tubo de ensayo 1:  Agregar X gotas o 0,5 g de la solución de hígado de pollo macerado y triturado.  Adicionar 2 mL de NaOH al 5%.  Mezclar y dejar en reposo durante 10 min.  Luego añadir 2 mL de agua oxigenada.  Finalmente mezclar, observar y anotar los resultados.



Tubo de ensayo 2:  Agregar 0,5 g de raspado del mesocarpio de la papa.  Adicionar 2 mL de NaOH al 5%.

 Mezclar y dejar en reposo durante 10 min.  Luego añadir 2 mL de agua oxigenada.  Finalmente mezclar, observar y anotar los resultados.



Tubo de ensayo 3:  Agregar 0,5 g de raspado de la pulpa o mesocarpio de la manzana.  Adicionar 2 mL de NaOH al 5%.  Mezclar y dejar en reposo durante 10 min.  Luego añadir 2 mL de agua oxigenada.  Finalmente mezclar, observar y anotar los resultados. Tubos Hígado (g)

1

2

3

0,5

Papa (g)

0,5

Manzana (g) NaOH al 5% (mL)

0,5 2

2

2

Mezclar y reposar por 10 min H2O2 (mL)

2

2

2

e) Efecto del Cl2Hg: 

Tubo de ensayo 1:  Agregar X gotas o 0,5 g de la solución de hígado de pollo macerado y triturado.  Adicionar 2 mL de Cl 2Hg al 5%.  Mezclar y dejar en reposo durante 10 min.  Luego añadir 3 mL de agua oxigenada.  Finalmente mezclar, observar y anotar los resultados.



Tubo de ensayo 2:    

Agregar 0,5 g de raspado del mesocarpio de la papa. Adicionar 2 mL de Cl 2Hg al 5%. Mezclar y dejar en reposo durante 10 min. Luego añadir 3 mL de agua oxigenada.

 Finalmente mezclar, observar y anotar los resultados. 

Tubo de ensayo 3:  Agregar 0,5 g de raspado de la pulpa o mesocarpio de la manzana.  Adicionar 2 mL de Cl 2Hg al 5%.  Mezclar y dejar en reposo durante 10 min.  Luego añadir 3 mL de agua oxigenada.  Finalmente mezclar, observar y anotar los resultados. Tubos Hígado (g)

1

2

3

0,5

Papa (g)

0,5

Manzana (g) Cl2Hg al 5% (mL)

0,5 2

2

2

Mezclar y reposar por 10 minutos H2O2 (mL)

3

3

3

8. Observaciones y resultados: Experimento #1

Tubo 1 (Hígado de pollo)

Tubo 2 (Papa)

Tubo 3 (Manzana)

Actividad catalítica de la catalasa

Observaciones: Hubo la formación de abundante espuma al momento de agregar el H2O2 y luego se formó un precipitado de color marrón blanquecino.

Experimento #2

Efecto de la temperatura

Tubo 1 (Hígado de pollo)

Observaciones: Hubo una menor efervescencia a comparación del tubo 1, y se formó poco precipitado blanquecino, se formaron 2 fases.

Tubo 2 (Papa)

Observaciones: Se origino poca efervescencia en comparación al tubo 1 y 2, y además se formó muy poco precipitado de color blanquecino, se formaron 2 fases.

Tubo 3 (Manzana)

Experimento #3

Observaciones: No hubo efervescencia y solo se formó poco precipitado de color marrón blanquecino.

Observaciones: No hubo efervescencia y solo se formó un precipitado gelatinoso de color blanco.

Tubo 1 (Hígado de pollo)

Tubo 2 (Papa)

Observaciones: Se formo un ligero precipitado de color anaranjado pálido y no hubo efervescencia.

Tubo 3 (Manzana)

Efecto del HCl al 0,5 N

Observaciones: Hubo una efervescencia mínima en comparación al experimento 1 y solo se formó abundante precipitado de color marrón blanquecino.

Observaciones: Hubo muy poca efervescencia y solo se formó un precipitado gelatinoso de color blanco.

Observaciones: Se formo un ligero precipitado de color anaranjado pálido y no hubo efervescencia.

Experimento #4: Efecto del NaOH al 0,5 M (No se realizó porque falto el reactivo de NaOH al 5%) Experimento #5

Tubo 1 (Hígado de pollo)

Tubo 2 (Papa)

Tubo 3 (Manzana)

Efecto del Cl2Hg

Observaciones: Se formo abundante precipitado de color blanco y hubo una efervescencia mínima.

Observaciones: Se formo abundante precipitado de color amarillo blanquecino y hubo una efervescencia mínima.

Observaciones: Se formo un precipitado de color anaranjado pálido y no hubo efervescencia.

9. Análisis de Resultados: 

Actividad catalítica de la catalasa:  Tubo 1: El hígado de pollo macerado reacciona con el H 2O2 dando como resultado abundante espuma (liberación de oxigeno) debido a que en órganos animales hay mayor actividad catalítica ya que se producen más toxinas las cuales deben ser eliminadas, y por lo tanto tendrán que actuar más catalasas. Otro factor, que influye es que: si el órgano (hígado de pollo) está más troceado, desmenuzado, la actividad catalasica será mayor ya que la superficie de contacto es mayor. En tejidos animales se desprenderá más calor, ya que la reacción de la catalasa es exotérmica.  Tubo 2: La catalasa contenida en la papa reacciona con el H 2O2 dando agua y oxígeno que, al ser un gas, tiende a salir y al hacerlo, burbujea. No se forma abundante espuma como en el tubo 1, debido a que en tejidos vegetales existe menor cantidad de proteínas totales y por ende su porcentaje de enzimas es menor. Con respecto a la formación de las 2 fases se debe a que la papa es rica en almidón y vuelve espesa la disolución formada.  Tubo 3: La cantidad de catalasa contenida en la manzana reacciona con el H 2O2 dando agua y oxígeno que, al ser un gas, tiende a salir y

al hacerlo, burbujea. No se forma abundante espuma como en el tubo 1, debido a que en tejidos vegetales existe menor cantidad de proteínas totales y por ende su porcentaje de enzimas es menor. 

Efecto de temperatura:  Tubo 1: No hay reacción con el H 2O2 porque el calor al desnaturalizar la catalasa presente en el hígado de pollo pierde sus funciones biológicas o enzimáticas.  Tubo 2: No hay reacción con el H 2O2 porque el calor al desnaturalizar la catalasa presente en la papa pierde sus funciones biológicas.  Tubo 3: No hay reacción con el H 2O2 porque el calor al desnaturalizar la catalasa presente en la manzana pierde sus funciones biológicas.



Efecto del Ácido clorhídrico 0,5 N:  Tubo 1: La catalasa contenida en el hígado de pollo reacciona con el HCl (a un pH ácido las proteínas se desnaturalizan) y al agregarle H2O2 ya no se produce el burbujeo o efervescencia.  Tubo 2: El HCl añadido desnaturaliza la catalasa presente en la papa (a un pH ácido las proteínas se desnaturalizan) y cuando añadimos el H2O2 no se produce reacción.  Tubo 3: La cantidad de catalasa contenida en la manzana reacciona con el HCl (a un pH ácido las proteínas se desnaturalizan) y al agregarle H2O2 ya no se produce la efervescencia.

 

Efecto del NaOH al 10%: (No se realizó porque falto el reactivo de NaOH al 5%) Efecto del Cl2Hg:  Tubo 1: La catalasa encontrada en el hígado de pollo reacciona con el cloruro de mercurio, el cual es un inhibidor enzimático, este cambia el sitio activo de la enzima, para que la catálisis se realice muy lentamente, este inhibidor o veneno enzimático, se une a la

enzima de forma covalente, por lo tanto, impide que la enzima pueda volver a actuar y ya no genere efervescencia (liberación de oxigeno).  Tubo 2: La catalasa contenida en la papa reacciona con el cloruro de mercurio, el cual es un inhibidor enzimático, este cambia el sitio activo de la enzima, para que la catálisis se realice muy lentamente, este inhibidor o veneno enzimático, se une a la enzima de forma covalente, por lo tanto, impide que la enzima pueda volver a actuar y ya no genere efervescencia (liberación de oxigeno).  Tubo 3: La cantidad de catalasa contenida en la manzana reacciona con el cloruro de mercurio, el cual es un inhibidor enzimático...