Taller Practico Forense 2020 PDF

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Biología Celular y Molecular 2020 - Departamento de Genética - Facultad de Medicina - UdelaR Tomado de Cibertorio creado por Angel Herráez

Aplicación de las Técnicas Forenses Simulación con un laboratorio Virtual

Fundamentos: Las pruebas de identidad genética se basan en la diversidad genética de los individuos, es decir, algunos difieren de otros con respecto a la secuencia de nucleótidos presente en diversas regiones del genoma, lo que se conoce como polimorfismo genético. El enfoque más frecuente es utilizar regiones polimórficas en el genoma que no codifican ningún producto (ya sea proteína o ARN) y, por lo tanto, no tienen ventajas o desventajas funcionales. Esto asegura que se distribuyen con gran diversidad en la población. Este ensayo se centra particularmente en varias regiones polimórficas conocidas como repetidos cortos en tándem o STR (short tandem repeats). Los STRs elegidos forman parte de un conjunto de marcadores utilizados mundialmente y conocidos como los marcadores CoDIS. La diferencia entre los alelos está en el número de repeticiones y, por lo tanto, en una electroforesis los identificamos por la longitud de fragmentos de ADN resultantes de la amplificación por PCR. Como material de partida tenemos muestras de ADN (virtuales) de la escena del crimen (por lo tanto, ADN que pertenece a la criminal desconocido) y de varios sospechosos. Cómo empezar: El laboratorio virtual funciona dentro de una página web, por lo que debe comenzar abriendo el navegador web en su computadora o tableta. Cualquier navegador moderno debería hacerlo, siempre que JavaScript esté habilitado (Firefox o Chrome son recomendables). Navegue a la página de Cybertory en http://biomodel.uah.es/lab/cibertorio/inicio.htm Ensayo: identificación genética de individuos por PCR multiplex Objetivo: Analizar los marcadores polimórficos para identificar al criminal, es decir, comparar a los sospechosos y los evidencia del crimen. El ensayo comienza con las muestras de ADN de cada sospechoso y de la muestra obtenida en el escena del crimen y consiste en realizar una amplificación por PCR de varios marcadores STR y separar los fragmentos amplificados por electroforesis. Al comparar los patrones de banda, se puede deducir cuál de los los sospechosos pueden ser quienes cometieron el crimen (o de lo contrario todos los sospechosos serán despedidos)

Biología Celular y Molecular 2020 - Departamento de Genética - Facultad de Medicina - UdelaR Tomado de Cibertorio creado por Angel Herráez

Procedimiento: Ingresar a http://biomodel.uah.es/en/lab/cybertory/ Comience presionando el botón "Iniciar Cybertory". Después de unos segundos, aparecerá un aviso solicitando que coloque un pedido con muestras y cebadores; por favor aceptalo. 1) Investigue el catálogo en línea. 2) Presione el botón "Realizar un pedido". 3) Seleccione "Conjunto de muestras para análisis forense (usando PCR)" y los pares de cebadores para los marcadores D3S1358, D8S1179, D18S51, D21S11 y Amelogenina. 4) En la parte inferior de la página, deberá proporcionar algunos datos. (Esta es una simulación de una situación de la vida real; no importa lo que escriba como nombre y apellido, pero es crucial que el usuario sea URU y la contraseña w5k.5w5. Son las asignadas para este práctico. 5) Presione el botón "Enviar pedido" y luego "Confirme el pedido". Espera hasta que la pantalla se actualice mostrando el laboratorio simulado (tubos, pipetas, etc.).

Posibles problemas: Si por algún error, necesita comenzar de nuevo con tubos nuevos, haga click en la imagen del contenedor a la izquierda de la caja de “puntas”. Después de hacer clic en un tubo, la pipeta, etc., permita que pase algo de tiempo. No sea impaciente. Si hace click en el émbolo de la pipeta y el cursor de la mano no desaparece, aleje el puntero del pipeta. Puede ver mejor el líquido dentro de un tubo haciendo que la pipeta salga del tubo; para hacerlo, haga clic nuevamente en el tubo.

ADVERTENCIA Este laboratorio es un simulador muy realista. Debe elegir en “Configuración …. una sola estrella. Si elige un nivel de complejidad mayor deberá considerar un uso adecuado de las “puntas” para evitar contaminar su reacción. En el modo una sola estrella puede utilizar siempre la misma “punta” para realizar las manipulaciones en la técnica de PCR. 6) Prepare mezclas de reacción para el ensayo de PCR en los tubos 1 a 6. Para evitar realizar la operación muchas veces podemos realizar un “Master Mix” y luego repartirlo en los 6 tubos.

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Para esto, debe realizar el Master Mix en el tubo 1:

1 tubo

Master Mix (6 tubos)

PCR Mix

5

30

Cebador D3

1

6

Cebador D8

1

6

Cebador D18

1

6

Cebador D21a

1

6

Amelogenina

1

6

Agua

20

120 (60x2)

Total

180 (30x6)

Desde el tubo 1 tomamos 30ul y los repartimos a los siguientes 5 tubos. De esta forma en cada uno de los 6 tubos quedan 30ul del Master Mix sin ADN. Ahora solo queda agregar el ADN de las muestras. • a cada tubo, 20 μl de una de las 6 muestras de ADN (D, S1, S2, S3, S4, S5); Al pipetear, es conveniente que marque en la tabla cada producto que vaya agregando. 7) Inicie la reacción de PCR presionando el botón "incubar" (ubicado en la parte inferior central, debajo del temporizador). Después de que termine el tiempo virtual requerido, la reacción se completará. Dependiendo de cómo es el laboratorio configurado, se puede mostrar una advertencia informando lo que se ha agregado a cada tubo; por favor verifique que coincide con lo esperado.

8) En el menú principal de Cybertory, seleccione "Electroforesis laboratorio ". Luego seleccione en el tanque el gel de poliacrilamida al 5%.

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Presione el botón de "carga automática", para que las 12 muestras preparadas en el proceso anterior se transfieran a los primeros 12 pocillos en el gel virtual. El número 13 se cargará automáticamente con una mezcla de estándares de tamaño (el ADN Ladder2TM). 9) Ajuste la fuente de alimentación a 250 voltios y 1 hora y 10 minutos. Encienda la corriente para iniciar el electroforesis. Durante la ejecución, puede encender la luz ultravioleta y apague las luces de la sala virtual para ver el ADN en movimiento.

10) Una vez que termine la electroforesis, dibuje un bosquejo de la posición de las bandas o capture una imagen usando la cámara digital conectada al tanque de electroforesis. Interprete sus resultados: 1) ¿Cuál de los sospechosos puede ser el criminal con cierta probabilidad? 2) ¿Cómo interpreta los resultados de los cebadores de la Amelogenina? 3) ¿Algunos de estos STR se encuentra en el mismo cromosoma? ¿Por qué sería importante?

Información sobre los STR https://strbase.nist.gov/fbicore.htm Virtual materials: Software: • “Cybertory” virtual molecular biology laboratory, biomodel.uah.es/en/lab/cybertory/ Virtual reagents: • Sample set for forensic analysis (bought from CygnusLab ), which contains nuclear genomic DNA coming from: • DNA extracted from the crime evidence. • DNA samples from five people suspected of having committed the crime (designated S1 to S5). • CygnusLab 10x PCR Master Mix containing • 250 U/mL CygnusTaq DNA polymerase • dATP, dGTP, dTTP, cCTP nucleotides, 2 mM each • 15 mM MgCl 2 • 125 mM TAPS buffer, pH=8.5 • PCR primer pairs, specific for CoDIS STR markers CSF1PO, D3S1358, D8S1179, D18S51, D21S11, FGA, TPOX and VWA, as well as for the sex-specific marker AMEL (amelogenin gen) used as a control • Ladder2TM DNA molecular mass marker (from CygnusLab )

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• Water, free from nucleases • Yellow pipette tips, usable from 1 to 100 μL • Agarose • Acrylamide, bisacrylamide, TEMED, ammonium persulphate, urea (to prepare the polyacrylamide gel) • 0.5x TBE electrophoresis buffer (Tris/Borate/EDTA) • Ethidium bromide • Gel loading dye (containing bromophenol blue, xylene cyanol and glycerol) Virtual instrumentation: • Variable volume micropipette up to 100 μL • CygnusLab PCtRonic ithermocycler • CygnusLab GelMatic Plus tank for gel electrophoresis

Corrida electroforética de prueba. En el carril 1 ADN evidencia, carril 2 al 6 el ADN de 5 sospechosos (S1 al S5). En los siguientes carriles se amplifico cada uno de los marcadores D3S1358, D8S1179, D18S51, D21S11 y amelogenina con el ADN de la evidencia. En el carril 13 se encuentra el marcador de peso molecular....