TD 2 Capelli Méthode d’extraction et de purification de l’ADN des échantillons particuliers PDF

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Nicolas CAPELLOCHE

Méthode d’extraction et de purification de l’ADN des échantillons particuliers Introduction 1ère étape dans la plupart des études de biologie moléculaire et dans toutes les techniques d’ADN recombinant L’extraction des échantillons biologiques nécessite un protocole adapté selon la nature  Pas de protocole universel

I.

Les critères de choix

Grande diversité de méthodes d’extraction et de purification des acides nucléiques. Principaux critères A. L’organisme source B. Le matériel de départ (tissu, feuille, graine, matériel transformé…) C. L’acide nucléique cible (ADN génomique total, ADN mitochondrial, ARNm…)  Les résultats escomptés (rendement, pureté…)  L’application en aval (PCR, RT-PCR, clonage, synthèse d’ADNc…) A + B = extraction C = purification

A. L’organisme source 

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Cellule procaryote o Accès à l’ADN : difficulté variable selon le type bactérien  Capsule (polysaccharides ou protéines)rôle protection et parfois virulence  Paroi mis en évidence par coloration gram (peptidoglycane)(concerne toute bactérie sauf mycoplasme)  Membrane plasmique (phospholipides) o ADN chromosomique libre dans cytoplasme o Pas d’histones car pas de compaction très forte repliement assurer par des topoisomérases.  Extraction de l’ADN relativement facile Attention à la neutralisation des polysaccharides L’organisme source peut être une cellule eucaryotte Cellule animale o Accès à l’ADN : élimination de :  Membrane plasmique (phospholipides)  Membrane nucléaire (phospholipides) o ADN lié au histones donc fortement compacter constitue contaminant dans extraction ADN  Extraction de l’ADN plutôt facile(pas de paroi ni de capsule)

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Cellule végétale o Accès à l’ADN :  Paroi pecto-cellulosique (pectines, cellulose, lignine, tanins…)  Membrane plasmique (phospholipides)  Membrane nucléaire (phospholipides) o ADN lié aux histones  Extraction de l’ADN plus difficile en raison des parois

B. Le matériel de départ Très grande variétés. Composition, conservation, pureté influencent l’extraction 

Culture cellulaire

Pas de tissu, pas de structure à dégrader, matériel frais et robuste. Extraction très facile. Difficulté : éviter contamination par champi ou bacteire.  Matériel idéal 

Sang

Problème de rendement : très faible l’lorsque extraction ADN. Peu de cellules avec noyaux donc peu d’ADN Leucocytes possède ADN (moins de 1%) Hème et héparine : puissants inhibiteurs de l’ADN polymérase. Si on fait PCR après pour extraction ADN Hème et héparine doivent avoir été enlever avant.  Matériel relativement facile 

Tissu frais (biopsie, cheveux…)

Biopsie tissus frais  Variable selon la structure Exemple : cheveux sans racine (pas d’ADN génomique mais mitochondrial) o o

Kératine à éliminer pour accéder à l’ADN( très difficile) Très faibles quantités d’ADN  Matériel difficile

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Fossile (os)

Peu de cellules ADN dégradés Difficile à extraire et très fragile  Matériel très délicat 

Organisme entier

Beaucoup de cellules fraiches

Nicolas CAPELLOCHE Très grande variabilité selon l’organisme Insectes avec cuticules externes (chitine)  Matériel compliqué 

Pelotes de rejection / fécès

ADN dégradés et d’espèces variées (reconstitution régime alimentaire) Barre coding : ADN de petite taille intérêt de repère pour chaque organisme un ADN caractéristique spécifique. Beaucoup d’autres composants organiques il faut un savoir-faire mais résultat intéressant  Matériel compliqué 

Carotte de sédiments

Peu de cellules ADN dégradé et fragile conservé dans milieu anaérobie Beaucoup d’inhibiteurs(ex : acide humique) important des ADN polymérase donc lorsque amplification par PCR : mauvais résultats  Matériel très difficile et délicat 

Feuilles, racines, graines

Paroi secondaire hydrophobe(compose phénolique) et rigide Racines contaminées par sol(matériel délicat) malgré lavage élément imprègne racine action limitante sur qualité ADN Excellente conservation des graines (sédiment) mais peu d’ADN et coque très rigide  Matériel compliqué

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Beaucoup de kits commerciaux spécifiques à disposition Parfois à adapter (protocole maison) – test de plusieurs kits de différents fournisseurs

C. L’acide nucléique cible 

Cellule procaryote(capsule(pas presente chez toute bacterie) =hanidcap supp pour extraction ADN) o ADN cytoplasmique o ADN plasmidique(extra-chromosomique  

Extraction classique pour l’ADN total Extraction par lyse alcaline (mini-prep) pour isoler l’ADN plasmidique

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Neutralisation permet renaturation intervient plus rapide pour ADN plasmidique de petite taille dans le surnageant on récupère surnageant qui va être traiter a l’éthanols pour précipiter ADN. 

Cellule eucaryote Cellule animale o ADN nucléaire o ADN o mitochondrial Cellule végétale o ADN nucléaire o ADN mitochondrial o ADN chloroplastique

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II.

Extraction classique pour l’ADN total Extraction spécifique pour isoler l’ADN mito ou chl ou séparation préalable des organites(grâce centrifugation differentielle) puis extraction

L’extraction de l’ADN

3 étapes : A. Fragmenter matériel biologique : Lyse cellulaire : broyage de la paroi et des membranes cellulaires et nucléaires pour accéder à l’ADN Obtention d’un lysat (homogénat brut) : acides nucléiques, autres composants(protéines, lipides, polysaccharides…) débris cellulaires et nucléases.. L’efficacité de la lyse est déterminante pour le rendement et l’intégrité des acides nucléiques

Nicolas CAPELLOCHE B. Purification de l’ADN : élimination des elements du lysat interagissant avec l’ADN, inactivation des nucleases (et des inhibiteurs de PCR ex : collagene ,hemoglobine..) protéines et des lipides interagissant avec l’ADN C. Récupération de l’ADN : précipitation de l’acide nucléique

A. La lyse cellulaire

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Mécanique Réservée aux cellules les plus résistantes : bactéries Gram +, champignons, spores, plantes, sols (sableux, argileux…), coraux, os, cheveux… Broyage manuel : Gros échantillons  mortier et pilon Petits échantillons  micro-pilon Broyage automatisé : Broyeur à billes(capsule en teflon avec bille acier par ex on regle vitesse de vibration en hertz par cycle de 30 seconde broyage)

 Choc thermique

Chimique

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Associé à un tampon de lyse ou à la congélation (N2 liquide) : Avantage congélation instantanée broyage plus efficace poudre plus fine  optimisation fragmentation.(Attention sécurité)  Préservation de l’intégrité de l’ADN (pH, antioxydant, inactivation de nucléases) Aide à la rupture des structures ASSOCIÉ A UN TAMPON DE LYSE : o PRESERVATION DE L’INTEGRITE DE L’ADN(PH , ANTIOXYDANT,INACTIVATION DE NUCLEASES o DESORGANISATION Des structures . Désorganisation des membranes par des détergents Ex : DETERGENTS de type Sodium Dodécyl Sulfate (SDS), Triton X100, sarcosyl Solubilisent les lipides membranaires sous forme de micelles Dénaturent +/- les protéines membranaires Et Utilisation de :  Phénol : précipitation des protéines  Guanidine : dénaturation des protéines et blocage de leur activité enzymatique  Bêta-mercaptoéthanol : agent réducteur Enzymatique

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Digestion des parois : Pour les cellules bactériennes, végétales et fongiques, on fragilise la paroi grâce à des enzymes

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Deproteinisation : proteinase K (endopeptidase, inhibiteur de DNases et RNases) pour des tissus riches en protéines (lait,yaourt,fromage..).

SDS déroule protéines en cassant les ponts disulfures.

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Perte de protection contre la forte pression osmotique intracellulaire : la cellule gonfle jusqu’à rupture ATTENTION : ces lyses peuvent être associer suivant le tissus.

B. La purification   

Consiste à éliminer les autres molécules de la cellule (protéines, lipides) et les inhibiteurs de PCR Importante chez les eucaryotes pour l’élimination des histones Nombreuses méthodes : Phénol/Chloroforme, lyse alcaline/SDS, chromatographie, séparation magnétique

Exemple 1 :

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La méthode d’extraction au CéTyltriméthylAmmonium Bromure (CTAB) : purification des acides nucléiques à partir des échantillons de plantes

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Polysaccharides polyphenols et proteines solubles sont elimines avec le surnageant apres centrifugation.

Exemple 2 :

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Kits commerciaux : précipitent les polyphénols, les acides humiques par baisse du pH

C. La récupération de l’ADN

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Consiste à précipiter l’ADN et à le concentrer pour une utilisation ultérieure Précipitation avec un sel(NaCl, acetate de sodium) associé à de l’éthanol ou de l’isopropanol Récupération par centrifugation

Après cette étape, le rendement et la qualité de l’ADN sont vérifiés :  Mesure de la quantité par un spectrophotomètre  Analyse de l’intégrité sur gels d’électrophorèse

D. Conclusion Face à un échantillon inconnu dont il faut extraire l’ADN, on cherche dans la bibliographie si quelqu’un a testé ou développé une méthode d’extraction efficace.  Sinon, il faut adapter les méthodes à « son » échantillon....