Tema 7. Psicrófilos. Adaptaciones de membranas PDF

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Apuntes con los que obtuve una calificación de 9.7 (Sobresaliente) con el profesor Amando Flores Díaz....

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Tema 7: Psicrófilos. Adaptaciones de membranas. Percepción del frio y choque frío Introducción La parte de la percepción del frío y choque frío siempre se incluye en el tema de psicrófilos, aunque también forma parte del estudio de mesófilos. Es importante porque hay psicrófilos que no nos interesan (aquellos que contaminan alimentos en frío por ejemplo) y ver cómo se adaptan a este frío. Se pueden acoplar sistemas de expresión al frío.

1. Adaptaciones de membranas Adaptación fenotípica: Aclimatación Adaptación genotípica: Adaptación

o o -

Adaptaciones fenotípicas y genotípicas de membranas: cambios en la composición de lípidos y proteínas Pequeño tamaño e “inmovilidad” de microorganismos, no se pueden aislar y no se pueden alejar del frío: Detección y reacción rápida a frío

Nosotros como individuos nos aclimatamos al frío o al calor, la adaptación la hizo la especie hace tiempo. Los psicrófilos están adaptados al frío pero al mismo tiempo realizan cambios que hacen que se aclimaten a los cambios de temperatura. Tanto termófilos como psicrófilos tienen adaptaciones. Un microorganismo no se puede aislar nunca del frío, por lo que ha de detectar y responder rápidamente a los cambios de temperatura.

1.1.

Problemas con el frío -

Disminución de la actividad hídrica por congelación. Estos organismos trabajan con muy poca agua, porque no está disponible en gran cantidad

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Congelación: aumento de la concentración de soluto en el agua residual

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Efecto en la conformación de la membrana y sus propiedades. Otros estreses, como escasos nutrientes, modifican la membrana

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Ciclos de congelación /descongelación rápidos que pueden originar daños por cambios osmóticos o formación de cristales de hielo. Ejemplo: polimerasas en el laboratorio se almacenan con glicerol para evitar su congelación y consiguiente formación de cristales

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1.2.

Estabilidad y temperatura

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Un cuarto de la membrana puede estar en estado de gel mientras los otros tres cuartos se mantengan funcionales.

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Homeofásica: organismo sensa el frío (uno de los primeros sensores es que la membrana se hace más rígida), y se activan unos ciertos genes

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A través de la membrana pasan muchas cosas, no es rígida. Todos los microorganismos tienen moléculas de este tipo, esteroles, hopanoides etc que modifican la fluidez de la membrana. A temperaturas bajas las membranas se vuelven demasiado rígidas, no hay movilidad ni transporte. A altas temperaturas se escapan los protones.  La composición de la membrana no es constante, va cambiando con la localización, tiempo, ciclo fisiológico, temperatura y cambia de un microorganismo a otro.

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1.3.

Bicapas y no bicapas

Depende de la forma del líquido En las membranas hay mezclas y la resultante es una bicapa La no bicapa genera tensiones importantes en esporulación, transporte, empaquetamiento de ciertas proteínas… - Bajas temperaturas favorecen las no-bicapas, lo que tiene que ser contrarrestado en psicrófilos -

No solamente encontramos estas estructuras, dependiendo de las condiciones encontramos distintas estructuras (si se baja la temperatura podemos encontrar parte de las membranas en estado gel, formando monocapas, formas cónicas, como la imagen de abajo, etc). En ciertas condiciones puede haber parte de la membrana que sea monocapa para poder realizar distintos eventos de transporte, empaquetamiento, cuando esporula, etc El frio va a favorecer que se formen monocapas, lo cual puede ser esencial para ciertas funciones pero no de manera general, el resto ha de ser bicapas.

1.4.

Cambios en la composición de ácidos grasos debido a la temperatura

1.4.1. Aumento en la proporción de ácidos grasos insaturados 1.4.2. Metilaciones de ácidos grasos 1.4.3. Disminución de la longitud de la cadena de los ácidos grasos Todo esto confiere más flexibilidad a la membrana, se va a empaquetar peor, siendo una estructura más ligera (al contrario que lo que interesaba en termófilos)

1.4.1. Aumento en la proporción de ácidos grasos insaturados -

Acidos grasos insaturados aumentan fluidez. Empaquetan peor por los dobleces originados por el doble enlace

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Respuesta al frío de microorganismos (bacterias y arqueas) y organismos superiores. Eucariotas procariotas, etc tienen esta respuesta rápida, cada uno utiliza su sustrato,etc

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Generalmente, enzimas desaturasas transfieren dos átomos de hidrógeno a aceptores como el O2 (aeróbico), Fe(III) o nitrito (anaeróbico). Las desaturasas van a modificar los ácidos grasos que ya están en la membrana, produciéndole insaturaciones adicionales. Esto es una respuesta rápida, no hay que producir en el citosol ácidos grasos insaturados nuevos, llevarlos a la membrana e insertarlos.

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Normalmente el sustrato es un ácido graso intacto de la membrana: poliinsaturados o monoinsaturados

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Ácidos grasos insaturados trans -

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Componentes de membranas de ciertas bacterias adaptadas al frío (Vibrio,Pseudomonas) Son producidos por enzimas cis/trans isomerasas Isomerización directa, in situ e irreversible de precursor cisinsaturado Proporción trans aumenta con estrés como hambre, tóxicos (fenoles y solventes) o aumento de temperatura La estructura de la membrana cambia, produciendo respuestas muy distintas. Son muchos cambios a la vez que han de estar bien regulados y compensados Fluidez intermedia entre saturado y cis-insaturado: respuesta inmediata de psicrófilos/psicrotolerantes para contrarrestar efectos de solventes o subida de temperatura (no síntesis de novo). Como son muchas respuestas que se producen al mismo tiempo, ha de haber un mecanismo de compensación (producir ácidos trans), existen pequeños cambios para contrarrestar cambios drásticos grandes. Se producen cambios importantes para justar la membrana, ajustar la fluidez de la membrana. Suben o bajan únicamente en el momento del estrés.

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Ejemplo: Aumento de % trans al reincubar tras condiciones de no crecimiento A, B, C son tres cepas de pseudomonas distintas adaptadas al frío. Fastidiando un poco al microorganimo, sometiéndolo a distintos estreses se producen muchos cambios distintos. Antiguamente se pensaba que estos cambios no eran fisiológicos, que la célula no producía estas moléculas. Estas tres cepas son parecidas pero no tienen la misma respuesta. A 8h se tienen los cultivos son exponenciales, a 48 encontramos crecimiento saturado. Se quitan de este medio y se ponen en un tampón sin nutrientes ฀ 1º) Exponencial. 2º) Cultivo saturado 3º) Se lava. 4º) Tampón. Medimos los ácidos grasos que tienen en cada momento. El estrés al que los sometemos genera un cambio en la proporción de ácidos grasos (no son un subproducto, los produce el microorganismo).

A la derecha tenemos los mismos microorganismos, y los sometemos a los siguientes pasos: 1º) Cultivo exponencial. 2º) Cultivo saturado. 3º) Congelar. 4º) Se saca del congelador. 5º) Se ponen a crecer. Un tiempo después de pasar del estado congelado a temperatura normal de crecimiento (estrés que les ha puesto la membrana más rígida), se produce un determinado ácido graso. Ciertos organismos adaptados al frío producen un cierto porcentaje de ácido graso para presentar la estructura y la conformación adecuada.

1.4.2. Ramificaciones metiladas -

Ramificaciones metiladas en distintas posiciones (iso, ante-iso) La proporción aumenta y cambiar al bajar la temperatura Principalmente psicrófilos/psicotolerantes gram positivas

Siempre en el sentido del aumento de la fluidez de la membrana. Se producen metilaciones, al aumentar el frio aumentan las ramificaciones.

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1.4.3. Longitud de la cadena de ácidos grasos -

El acortamiento de la cadena aumenta la fluidez de la membrana

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Asociado a otros cambios como proporción de insaturaciones o ramificaciones metiladas

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Excepción: Psicrotolerante Psychrobacter oleovorans, regula la fluidez de la membrana disminuyendo únicamente la proporción C18/C16 de sus ácidos grasos. Solo cambia la proporción de los ácidos grasos de la membrana y con esto vive a bajas temperaturas (al igual que algún termófilo excepcional que con solo un único cambio se adaptaba) Estos tres cambios importantes aumentan fluidez

Siempre hay que ir a lo contrario que hace la temperatura para sobrevivir.

Carotenoides -

Carotenoides más polares estabilizan más la membrana que los menos polares. Van en sentido contrario, a compensar, no a aumentar la fluide

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La proporción entre ambos (carotenoides polares y no polares) regula la fluidez de la membrana dependiendo de la temperatura de crecimiento.

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Esto va al contrario de lo que uno piensa. Los carotenoides hacen lo contrario reducen la fluidez, son cambios menores que compensan los cambios. Si tenemos una estructura de membrana, si bajamos la temperatura, hace falta que los carotenoides estabilicen la membrana. Esto no es que haya o no haya, simplemente cambia el tipo de carotenoides.  Ejemplo: Sphingobacterium antarticum. Aumento de polares y disminución de los menos polares al pasar de 25ºC a 5ºC. Los polares compensarían el aumento de fluidez por aumento de insaturados y ramificaciones metiladas.

Cuando se baja la temperatura se producen una serie de cambios para darle fluidez a la membrana. Y los carotenoides actúan al revés, son pequeños cambios para compensar los cambios radicales que ocurren en las membranas.

Las más polares estabilizan más Página 6 de 21 Luis Pedro Gª-San Segundo Jiménez. Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad Pablo de Olavide. [email protected]

2. Proteínas anticongelantes Esto no tiene mucho que ver con las membranas, pero lo metemos aquí. Presentes en plantas, peces, insectos y bacterias. Cualquier cosa que vive en frío (no solo microorganismos) presentan proteínas anticongelantes: proteínas de composición muy distinta entre distintos organismos, con una estructura que se une al cristal de hielo para impedir o retardar su crecimiento. Presentan repeticiones o conservaciones de este tipo de interacciones con las moléculas de hielo. Se unen a los cristales de hielo e impiden su crecimiento, disminuyen su temperatura de congelación. La consecuencia es que disminuye la temperatura de congelación.

Cristales de hielo con proteínas anticongelantes:

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3. Crioprotectores Moléculas muy diversas que funcionan como crioprotectores, los cuales protegen del frío (al igual que hacen los solutos compatibles). Mejoran entorno para los componentes celulares y mantener condiciones adecuadas -

Proteínas

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Trehalosa: efecto coligativo y probablemente efecto evitando desnaturalización y agregación de proteínas (por frío)

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Exopolisacáridos: se producen de manera activa, o Modifica las características físico-químicas del entorno o Participa en adhesión celular a superficies y retención de agua (aunque estén asociados a hielo, la vida de estos microorganismos requiere agua y ésta es de disponibilidad muy baja) o Favorece secuestro y retención de nutrientes o Retiene y protege enzimas extracelulares contra la desnaturalización por frío. En general los microorganismos secretan proteínas para comerse moléculas externas (demasiado grandes para introducirlas al interior, las rompen fuera e ingieren fragmentos de ésta) o Crioprotector (protegen del frío en general)

4. Percepción y transducción de la baja temperatura en bacterias Esto se da en todos los organismos, pero ha de ser muy importante en psicrófilos. Choque frío: bajada de temperatura muy drástica, son cambios muy drásticos. En general todos los organismos perciben cambios en la temperatura. Estos cambios de temperatura se producen en muchas condiciones. Es muy importante en patógenos y es importante saber cómo combaten el frío para atacarlos. Algunos dentro del hospedador llegan a 37º y en el suelo muy bajas temperaturas, requiere expresar unos u otros genes. -

Esencial para sobrevivir al frío en todos los organismos Cambios en el ambiente, patógenos,.. Respuesta al choque frío Percepción al frío, cambios en la conformación. Ocurren cambios en la rigidez de membranas, moléculas, etc en general o Membranas: interfase entre medio interno y externo  Reducción en fluidez o Biomoléculas: DNA, RNA, proteínas. Todo tipo de interacciones entre ácidos nucleicos (que se pegue el mensajero en el ribosoma, etc) en condiciones normales, se van a aumentar y van a ser más estables de la cuenta en condiciones de frío. Esto no conviene. Los ribosomas son sensores de frío gracias a este aumento de interacciones (interaccionan con el mRNA)  Rigidez o bloqueo del ADN alterando transcripción o traducción (posible señal para patógenos) o Ribosomas

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Supone la remodelación de la expresión génica. Todo esto (mensajeros que hagan bucles, etc) van a hacer que cambie la expresión génica y se produzcan unas determinadas proteínas ฀ supone la remodelación génica - No hay factores sigma descritos (a diferencia del choque térmico) que hagan que la polimerasa reconozca a sus promotores. Habrá proteínas reguladoras que decidan qué genes hay que expresar y cuales no.

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Efectos en la membrana -

Cambios en la fluidez. Esto va a ser una señal, va a provocar: Cambios en la desaturación de ácidos grasos: aumenta proporción insaturados Cambios en la proporción trans-cis: aumenta cis Carotenoides

Percepción de la temperatura: sistema de dos componentes Una proteína sensora (muchas veces en la membrana) detecta cambios en el ambiente y adquiere actividad fosfatasa o quinasa. Esta proteína modifica al regulador de la transcripción, el cual en estado fosforilado o defosforilado activará o reprimirá unos determinados genes al regular el DNA. Muchos de estos sistemas de dos componentes presentan un componente en la membrana y el otro de forma soluble.

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Percepción de la temperatura: sistema de dos componentes (bacillus) (Examen) Para que la respuesta sea rápida, se produce la enzima desaturasa, la cual va a la membrana y produce insaturaciones allí. Aparte de que se cambie la estructura (longitud, etc) de los ácidos grasos, presencia de hopanoides, etc; una de las cosas que se hace cuando disminuye la temperatura es introducir insaturaciones.

 A: bicapa lipidica de Bacillus a temperatura donde puede crecer óptimamente. A esta temperatura encontramos la membrana con mosaico fluido (líquido cristalino), funcionan el transporte, etc (condiciones normales de funcionamiento). DesK es una proteína de membrana que actúa como sensor. Como la membrana está bien, no es necesario modificar la composición de la membrana a esa temperatura, no hay que producir insaturaciones, por lo que DesK (que no está detectando cambios en la fluidez, rigidez, etc) defosforila al regulador de la transcripción DesR, el cual pasa a su forma inactiva. El regulador suele ser constitutivo, suele haber cierta cantidad de RNAm de desR y desK. La proteína Des que es la desaturasa no está presente en este caso.  B: Estado intermedio, aclimatación a bajas temperaturas. Cuando baja la temperatura, el microorganismo va a seguir creciendo, pero la composición de la membrana va a cambiar: se hace más rígida, los fosfolípidos se organizan más. Este cambio lo detecta DesK (inserta en la membrana), y ahora adquiere actividad quinasa y fosforila a DesR, obteniendo el regulador en forma activa. DesR es un activador de la transcripción que con fosfato (en la forma activa) va a su diana y promueve la transcripción del siguiente gen: des (entre medias está un terminador de la transcripción) (genes en minúscula y cursiva y proteínas en mayúscula la inicial y normal)  C: ya se ha aclimatado. Proteína Des va a la membrana y modifica los ácidos grasos de la membrana, donde produce insaturaciones. Por otro lado habrá otro tipo de modificaciones (metilaciones, acrotamiento, etc). Cuando ya ha ocurrido la aclimatación tenemos una membrana con una composición distinta, pero que a esa temperatura tiene una estructura equivalente a la que presentaba a la temperatura inicial en la que funcionaba con normalidad. Composición es distinta en A y C pero la función es igual. Ya ha llegado al nivel de fluidez que le conviene, por lo que no requiere la actividad de Des. Puesto que DesK ya reconoce situación óptima de fluidez de la membrana, ejerce actividad fosfatasa defosforilando al regulador y se deja de producir Des. Además, parece ser que la presencia de ácidos grasos insaturados inhibe o afecta negativamente la transcripción de Des.

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DesK tiene función quinasa cuando el entorno está en conformación rígida y actividad fosfatasa cuando el entorno es fluido.

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La regulación ha de ser una respuesta rápida a un cambio.

DesR puede estar activa o inactiva, uede ser activador o anctivador, se pega al promotor, produciendo mensajero, proteína. El Acido graso cambia la estructura de membrana

Expresión de des dependiente de DesK y DesR Esto es para demostrar que la expresión de Des depende de DesK tanto como de DesR. Tenemos el promotor de la desaturasa funcionado a lacZ, cuando se expresa Des, se ve color amarillo de lacZ. Este ensayo se hace con el Bacillus de antes. Las bolitas son el silvestre. Hago una fusión como ese promotor. Si yo tengo que ver que la desaturasa se expresa no, lo que se mide es la expresión de betagalactosidasa, no d desaturasa. La desaturasa se expresa, produce instauraciones y ya no se expresa más. Se produce una subida y una bajada, porque al arreglarse la se deja de expresar. Es importante donde lo fusionamos porque si no subiría y nunca bajaría. En cualquier caso tengo que tener una copia silvestre de la proteína que además este regulada.

Se representa actividad de la beta galactosidasa frente al tiempo. A 37ºC no se está expresando la desaturasa. Cuando baja la temperatura a 25º, cambia la composición de la membrana, aumenta la expresión de la desaturasa y cuando ya se ha corregido la composición de la membrana ya no hay mensajero de desaturasa. Los mutantes DesK-DesR- no expresan la proteína Des (DesK y DesR son reguladores positivos de Des, por lo que si no están nunca van a expresar Des, no cambiará la composición de la membrana).

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