Tema 6. Psicrófilos. Adaptaciones de proteínas PDF

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Apuntes con los que obtuve una calificación de 9.7 (Sobresaliente) con el profesor Amando Flores Díaz....

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Tema 6: Psicrófilos. Adaptaciones de proteínas Introducción En este tema no vamos a ver nada sobre protección de DNA, ya que el frio no afecta a esta molécula. Sin embargo si veremos características de adaptación de otras estructuras celulares, como la membrana, ya que el frio produce una sobreestabilización de las estructuras y los complejos intracelulares.

1. Los psicrófilos Los organismos psicrófilos son los organismos más abundantes en el plante, ya que la mayoría del mismo rara vez alcanza más de 5 grados centígrados de temperatura: polos, océanos, profundidades marinas, montañas y ambientes creados por el hombre. Cuando hablamos de ambientes creados por el hombre normalmente nos referimos a aquellos en los que se mantiene una cadena de frio. En el hielo también hay líquido, aunque este está a baja temperatura y tiene una baja disponibilidad, por lo que se convierte en un ambiente muy inhóspito para cualquier organismo. Por ejemplo, en la imagen de la izquierda podemos apreciar que en la grieta existente en el hielo hay vida, comprobado mediante inmunofluorescencia. Se han llegado a describir organismos habitando a una temperatura de 20 grados bajo cero. Entre los organismos capaces de sobrevivir a estas temperaturas encontramos: o

Psicrotolerante o psicrotrofos: Estos tienen un crecimiento óptimo a una temperatura mayor de 20 grados, pero son capaces de crecer bien en temperaturas alrededor de 0 grados.

o

Psicrófilos: Estos tienen un crecimiento a una temperatura menor o igual a 15 grados centígrados, siendo incapaces de crecer a temperaturas mayores de 20 grados centígrados. Estos son los organismos que han sido descritos a 20 grados bajo cero.

Menos 20 grados es un congelador.

1.1 ¿Dónde se encuentran y quiénes son? Estos organismos se encuentran tanto en agua como en hielo, suelo y animales. Además, los podemos encontrar en ambientes tan inhóspitos como los polos, océanos, profundidades marinas, montañas y ambientes creados por el hombre, en los cuales hay una importancia económica, ya que normalmente no queremos que los materiales conservados en una cadena de frio sean degradados por microorganismos capaces de resistir estas temperaturas. La temperatura mínima a la que se han encontrado estos organismos es, como hemos dicho anteriormente, a -20ºC, normalmente encontrados en permafrost (suelo helado) y en hielo marino. Además, los podemos encontrar en banquisas, que son las cornisas que sobresalen a la franja de tierra en los polos, en los cuales aunque no haya suelo (al contrario que en el permafrost) si hay materia orgánica, por lo que estos organismos son capaces de crecer.

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Entre los organismos que son capaces de sobrevivir a estas temperaturas encontramos bacterias, arqueas (sobre todo en las profundidades marinas), cianobacterias, algas, hongos, etc. Un ejemplo lo encontramos en la imagen de la derecha, Chalmydomonas nivalis, un alga que cuando crece en nieve es capaz de teñirla de rosa.

2. Para sobrevivir y crecer a baja temperatura Para conseguir sobrevivir a estas temperaturas, debido a la característica de que el frio hace las estructuras más rígidas y estables, alterando la fluidez de membrana, la flexibilidad requerida por las proteínas, etc. encontramos que los microorganismos psicrófilos han desarrollado una serie de adaptaciones que compensan este aumento en rigidez: o

Enzimas con más flexibilidad estructural. Aumenta la flexibilidad estructural de las enzimas de mesófilo, al contrario de lo que ocurría en termófilos. Esto hace que aunque la temperatura baje la enzima se mantenga lo suficientemente laxa y flexible como para poder desempeñar su función.

o

Membranas con componentes que permitan flexibilidad y transporte a bajas temperaturas. Esto se consigue modificando la composición de la membrana, haciendo que esta sea más fluida y permitiendo que a baja temperatura tengan lugar procesos de interacción, reacciones con las proteínas de membrana, difusión de elementos, etc.

o

Síntesis rápida de crioprotectores. Al igual que los termófilos generan solutos compatibles para sobrevivir, los psicrófilos generan unas moléculas, como exopolisacáridos y proteínas de choque frio, que lo que hacen es proteger las proteínas, evitar que el agua citosólica se congele, entre otros.

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3. Usos biotecnológicos: reales, potenciales o en estudio En biotecnología, son muy importantes las enzimas para hacer tratamientos a baja temperatura, lo cual nos permite que las enzimas tengan una alta actividad a estas temperaturas bajas; y además nos interesa que sean termolábiles, es decir, que pierdan la actividad cuando aumentamos la temperatura. La ventaja de esto sería que un tratamiento a baja temperatura podría detenerse con un aumento de temperatura, y esto puede ser muy favorable en industria, ya que de esta forma una vez hecho el tratamiento el producto no volvería a alterarse, al haber inactivado las enzimas encargadas de este procesamiento. Entre las industrias encontramos: -

Industria alimentaria: No se puede poner tratamiento que funcione a temperatura alta, ya que en este caso estoy modificando de forma directa el alimento. Además, una vez he tratado el alimento me interesa desactivar la enzima para que el producto se quede como yo deseo. Es decir, lo ideal es que se pueda tratar a temperatura baja, principalmente a la temperatura de conservación, y además con subir un poco la temperatura la enzima quede desnaturalizada de forma irreversible. Además, pueden usarse para tratamientos en biología molecular relacionados con DNA o proteínas principalmente. Encontramos: o Enzimas para ablandar la carne. o β-Galactosidasa para reducir la lactosa de la leche a temperatura de almacenamiento. o Peptinasas en extracción de zumos de fruta: aumentan el rendimiento, reducen la viscosidad y favorecen la clarificación.

-

Aditivos en detergentes: Principalmente se busca que trabajen a temperaturas bajas por el ahorro energético que supone el no tener que calentar el agua para utilizarlas. Tenemos: o Proteasas, lipasas, alfa-amilasas y celulasas para lavados en frio. o Subtilisina, una proteasa usada en industria y que se podría usar para tratar las lentes de contacto en frio, para limpiarlas diariamente sin tener que calentarlas. Está en estudio actualmente.

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Industria textil: En la industria de este tipo se suelen utilizar las enzimas para el tratamiento de las materias primas, como: o Tratamiento de fibras de algodón, ya que la fibra se deteriora si se calienta de forma repetida.

-

Biorremediación a bajas temperaturas: Principalmente se busca poder tratar vertidos, remediación in situ. Esto sería beneficioso ya que la mayoría de problemas de vertidos se dan en lugares en los que la temperatura es baja, como mares, y por tanto la mejor forma de biorremediarlos sería usando organismos psicrófilos.

-

Biocatálisis con baja agua: Esto, aunque no tiene que ver directamente con la temperatura también está aplicado a psicrófilos. Aquí, el beneficio que reporta es que los psicrófilos, al estar adaptados a crecer con baja cantidad de agua (como en la grieta del hielo), pueden crecer con menor cantidad de agua que otros microorganismos, lo que supone un beneficio.

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Biología molecular: En biología molecular, el trabajar a bajas temperaturas reporta diversos beneficios, como: o Producción de proteínas recombinantes a temperaturas menores de 30 grados evita que se produzcan agregados de proteínas por interacción entre ellas y la formación, por tanto, de cuerpos de inclusíon. o Uso de enzimas que deben inactivarse en protocolos secuenciales. Es decir, puedo hacer un tratamiento por debajo de la temperatura de degradación de una molécula y luego hacer que esta enzima se desactive. Un ejemplo es el uso de enzimas cuya temperatura de inactivación esté por debajo de la de desnaturalización del DNA.

Además, el conocimiento en proteínas psicrófilas, junto con las termófilas, son modelos de adaptación de proteínas a temperaturas bajas y altas. Estas pueden utilizarse para establecer modelos de plegamiento y adaptación a temperaturas diferentes y además para generar modelos de vida en otros planetas, como Marte, donde sabemos que las temperaturas son más bajas.

3.1 Bioprospectos -

Bioprospector.org

3.2 Lago Vostok El lago Vostok es una historia que está ahora mismo un poco parada. Este es un lago localizado en la Antártida, un lago subterráneo que lleva millones de años aislado del resto de la Tierra, y no ha tenido contacto con la atmósfera por tanto, por lo que no ha evolucionado de forma similar al resto de ambientes que si están en contacto con la misma, incluyendo de esta forma a los organismos que en él habiten. El agua de este lago ha permanecido líquida debido a una posible fuente de calor cerca del mismo. Además, hay un número limitado de nutrientes, y combinado a la temperatura hace de este lago un lugar inhóspito para que crezcan la mayoría de organismos. Hace ya algunos años, los rusos empezaron a perforar este lago. Sin embargo, esta perforación se puso en pausa hasta que no se desarrolló una tecnología que permitiera recoger muestras del lago asegurando que este iba a seguir estando aislado, evitando así contaminaciones biológicas. Esto se consiguió y se completó la excavación y posterior extracción, secuenciando los organismos contenidos en las muestras obtenidas. Lo que se observó es que había tanto procariotas como eucariotas, además de un organismo supuestamente de una especie distinta, un organismo “extraterrestre”, aunque esta noticia era más sensacionalista que científica.

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4. Efecto de las bajas temperaturas Cuando las temperaturas descienden, como hemos dicho, se produce un efecto sobre diversas estructuras celulares: -

Rigidez de membrana citoplasmática y enzimas. O de cualquier estructura si hablamos de eucariotas, se verán afectados y aumentarán su rigidez. Cuanto más extremo es el medio, encontramos que los organismos que van quedando son extremófilos. Cuanto más complejo es un organismo, es más fácil que se estropee, por lo que tiene menor resistencia a cambios de temperatura.

-

Efecto negativo en permeabilidad, transporte activo y pasivo de nutrientes y desechos, transporte de protones, electrones, fotosíntesis, detección de señales ambientales, catálisis, etc. Hay una consecuencia principalmente en la membrana, que aumenta la rigidez, lo cual induce la mayoría de otros efectos. Tenemos que las enzimas también se vuelven más rígidas y además se pierde la estructura líquida cristalina que caracterizaba la membrana.

-

Efecto negativo en plegamiento y desnaturalización por frio. La baja temperatura, además, tiene mal efecto sobre el plegamiento, ya que un péptido a baja temperatura se pliega muy mal, pudiendo incluso desnaturalizarse.

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Baja transcripción y traducción, estabilización de estructuras secundarias de DNA y RNA. Si bajamos la temperatura del medio a cualquier microorganismo estamos afectando a las interacciones que incluyan ácidos nucleicos, ya que se estabilizan los enlaces entre ellos. Esto hace que no sea fácil desnaturalizar el DNA para replicarlo, o que incluso estructuras de ácidos nucleicos, como RNA transitorios, se mantengan más tiempo del que deberían de forma estable, afectando a su función.

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4.1 Adaptaciones moleculares de enzimas de psicrófilos Lo que sabemos es que las bajas temperaturas disminuyen e inhiben las reacciones bioquímicas catalizadas por enzimas, siguiendo la ecuación que determina su valor, donde la temperatura está en el denominador del exponente:

La constante catalítica es el máximo número de moléculas de sustrato convertidas a producto por centro activo y unidad de tiempo. Al ser un exponente negativo tenemos que a mayor temperatura, mayor constante catalítica, y conforme disminuimos la temperatura, la constante será menor; llegando incluso a detenerse. También tenemos que esta constante disminuye con la energía de activación. Este es un problema presente en psicrófilos debido a la baja temperatura de su ambiente, y que deben solventar.

4.2 Efecto de la temperatura en la actividad de enzimas psicrófilas vs mesófilas En este caso vemos el efecto que tiene la temperatura sobre la enzima α amilasa de un organismo mesófilo (obtenida del páncreas) y de un organismo psicrófilo, como es Pseudoalteromonas haloplanktiis. Podemos observar que la actividad a la temperatura óptima del organismo mesófilo hay mayor actividad de la enzima de psicrófilo gracias a las adaptaciones que ha adquirido para poder trabajar a temperaturas bajas. Sin embargo, vemos que como ha adoptado estas medidas, la actividad decae muy rápido al pasar de los 30 grados centígrados, mientras que la actividad de la enzima de páncreas mantiene su actividad hasta casi los 80 grados centígrados.

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5. Características de enzimas psicrófilas vs. Mesófilas Entre las características que encontramos de las enzimas psicrófilas es su alta eficiencia a bajas temperaturas: -

La actividad específica es hasta 10 veces superior a las enzimas mesófilas a temperaturas bajas, siendo mucho más eficaces a estas temperaturas que las mesófilas.

-

La máxima actividad de estos microorganismos, y estas enzimas, se da a temperaturas bajas. Esto ocurre porque estas enzimas sólo funcionan en frio, están adaptadas a ello, y cuando aumentamos la temperatura suelen desestabilizarse y desnaturalizarse, fenómeno denominado inestabilidad térmica. Esto suele ocurrir porque estos organismos no han sido forzados a vivir en un ambiente cálido, por lo que no han tenido la necesidad de adaptar sus enzimas para este tipo de ambientes también. Además, a veces la actividad máxima de la enzima psicrófila puede ser mayor que la del mesófilo.

-

En muchos casos ocurre que las enzimas son homólogas y la enzima de psicrófilo tiene un máximo menor que la enzima de mesófilo, como ocurre con el ejemplo de la α-amilasa. Esto ocurre porque la adaptación al frio no es perfecta, por lo que la actividad máxima a la temperatura de crecimiento óptima del organismo psicrófilo es menor que la actividad máxima de la mesófila a su temperatura. Esto se puede modificar añadiendo más modificaciones a la enzima psicrófila para que aumente su eficacia; además de que no siempre ocurre.

Además, tienen una alta eficiencia catalítica a baja temperatura y una baja termoestabilidad, son muy termolábiles, por lo que se inactivan con calor muy fácilmente. Esto puede ser beneficioso, por ejemplo, cuando estamos realizando tratamiento de algún producto a temperatura de conservación y no queremos que a temperatura ambiente siga siendo tratado. En la gráfica de la derecha podemos observar la actividad residual de la enzima β-lactamasa procedente de un microorganismo psicrófilo y mesófilo tras incubar a 50 grados centígrados. Vemos que la actividad de la enzima psicrófila (negro) desciende rápidamente mientras que la enzima mesófila (blanco) mantiene su actividad durante mucho tiempo.

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Alta eficiencia, baja estabilidad y alta flexibilidad (a mayor flexibilidad, menor estabilidad) Además tenemos que las enzimas tienen una alta flexibilidad, aportando esto a su baja estabilidad pero mejorando su eficiencia. Una enzima en su estado nativo no adopta una única conformación, sino que hay una que predomina sobre una población de conformaciones fluctuantes. La flexibilidad principalmente tiene que estar enfocada al centro activo del enzima, ya que requiere adaptarse a la forma de los diferentes sustratos para poder actuar. Normalmente esta fl exibilidad se consigue cambiando residuos aminoacídicos, cambiando algunos más voluminosos por otros menos voluminosos. Como antes, la situación más simple de entender es la de la α-amilasa, en el cual se aumenta la temperatura y se ven los cambios en la estructura por colorimetría: los picos en la gráfica son cambios de estructura del enzima, que normalmente deriva en pérdida de función. La P indica que el enzima es de psicrófilo, y la M indica que es de mesófilo. Vemos que en el caso de α-amilasa hay sólo dos picos, uno en el enzima psicrófilo y otro en el mesófilo. Sin embargo, en el caso del fosfoglicerato quinasa tenemos que en el enzima psicrófilo hay dos picos. Esto se debe a que en caso de que el sustrato sea pequeño, las modificaciones se hacen sólo en las zonas colindantes al centro activo, permitiendo que el resto del enzima quede más rígido, y por tanto necesitemos más temperatura para poder desnaturalizarlo. Sin embargo, como la amilasa es un sustrato grande, toda la estructura de α-amilasa tiene que ser modificada. El sitio activo es muy estable comparado con el resto de la proteína.

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5.1 ¿Dónde se encuentran las diferencias estructurales? También era una pregunta típica hablando de organismos termófilos. Las diferencias no son muy grandes, no hay conformaciones específicas para psicrófilos y no hay grandes alteraciones en las secuencias de aminoácidos, sin embargo encontramos que las enzimas son normalmente superponibles pero presentan pequeñas variaciones. Los sitios activos suelen estar muy conservados, ya que para hacer las mismas reacciones hay que conservarlos lo más posible. Los cambios para modificar la estabilidad y función de la temperatura se realizan, por tanto, en otros sitios: -

Se modifica el entorno del centro activo para hacerlo más flexible, pero permitiendo que el centro activo conserve su actividad. Se modifican las propiedades dinámicas y conformacionales de los residuos conservados.

-

Mayor accesibilidad a los sitios activos, permitiendo que el producto y el sustrato fluyan bien.

Mayor accesibilidad a sitios activos Esto se consigue, por lo general, de forma contraria a la termófila; aunque todavía faltan estudios por realizar. En general, lo que hace falta es que el sitio activo sea flexible, con una cavidad más grande y accesible a ligandos, lo que se consigue: -

Quitando o cortando lazos cercanos al sitio activo.

-

Usando cadenas laterales más pequeñas, cambiando los aminoácidos que no sean importantes por otros más pequeños.

El cambio del sitio activo también hace que se requiera menos energía para la acomodación enzima-sustrato, reduciendo la energía de activación, e induce una salida facilitada del producto. Con esta modificación encontramos una consecuencia positiva y una negativa: -

La consecuencia positiva es que el rango de especificidad es más amplio. Si hacemos un sitio más accesible a cualquier cosa podemos hacer que el enzima use otros sustratos parecidos al que usa normalmente, aunque no todos funcionen bien. En la tabla tenemos un alcohol deshidrogenasa psicrófila, viendo la a...