TEMA 9 - Apuntes 9 PDF

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Recombinación en bacterias...

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TEMA 9: RECOMBINACIÓN EN BACTERIAS 1. MATERIAL GENÉTICO BACTERIANO: Las bacterias son organismos unicelulares que carecen de membrana nuclear. En la mayoría de los casos, el genoma se corresponde con un cromosoma circular que contiene una molécula de DNA única de varios millones de pares de bases. Estos cromosomas suelen estar organizados de manera eficiente, con escasa cantidad de DNA entre genes (no tienen DNA no codificante). Además de tener un cromosoma, muchas bacterias poseen plásmidos, pequeñas moléculas circulares de DNA que poseen genes que no son esenciales para las funciones bacterianas pero pueden desempeñar un papel importante en su ciclo de vida. Estos plásmidos son muy utilizados en la ingeniería genética. La mayoría de ellos son circulares y constan de varios miles de pares de bases de longitud. Tienen su propio origen de replicación. Los episomas son plásmidos capaces de replicarse libremente e integrarse en los cromosomas bacterianos. 2. TRANSFERENCIA GENÉTICA EN BACTERIAS: En procariotas no hay mecanismos sexuales, se llaman parasexuales porque hay una bacteria donadora y otra receptora. Los individuos finales se denominan merocigotos o diploides parciales. -

CONJUGACIÓN Tiene lugar cuando el material genético pasa de forma directa de na bacteria a otra. En la conjugación dos bacterias se encuentran próximas y se forma una conexión entre ellas. Un plásmido o parte del cromosoma bacteriano pasa a una célula receptora. Después de la conjugación, se produce un entrecruzamiento entre las secuencias homólogas de DNA transferido y el cromosoma de la célula receptora. El intercambio no es recíproco y sólo se transfiere una hebra.

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TRANSFORMACIÓN Tiene lugar cuando la bacteria capta el DNA del medio en el cual se desarrolla. Después de la transformación puede ocurrir la recombinación entre los genes introducidos y los de la bacteria o no.

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TRANSDUCCIÓN Tiene lugar cuando los virus bacterianos transportan el DNA de una bacteria a otra. Al igual que en el caso anterior, la recombinación no es obligada.

Estos mecanismos de intercambio genético difieren de la reproducción sexual en dos principales aspectos: el intercambio de DNA y la reproducción no están asociados en las bacterias; y el material genético donado que no recombina dentro del DNA del huésped generalmente se degrada para que la célula permanezca siendo haploide. El tipo de reproducción está relacionada con el metabolismo de las bacterias y su uso. La mutación, espontánea o inducida, permite reunir un gran número de fenotipos bacterianos con los que realizar análisis genético. Algunos de los más utilizados son la resistencia a antibióticos y las auxotrofías. Los mutantes auxótrofos son portadores de defectos metabólicos que impiden a la bacteria crecer en un medio mínimo, donde sí lo hacen las cepas silvestres (protótrofas). 3. TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DE BACTERIAS: Como ya se ha dicho, algunas bacterias presentan deficiencias metabólicas que impiden su desarrollo en un medio mínimo. Éste es aquel que contiene sólo los nutrientes requeridos por las bacterias protótrofas. Las bacterias auxótrofas carecen de una o más enzimas necesarias para metabolizar los nutrientes o sintetizar moléculas esenciales y sólo crecen en un medio suplementado con uno o más nutrientes. Un medio completo es aquel que contiene todas las sustancias requeridas por las bacterias para crecer y reproducirse. Los cultivos bacterianos suelen crecer en un medio líquido estéril o en placas de Petri con agar sólido. La ventaja de las placas de Petri es que permiten aislar y contar las bacterias. Una cualidad de las bacterias que permite su estudio en agar sólido es la capacidad que poseen para formar colonias, que son grupos de bacterias genéticamente idénticas. Esto permite aislar bacterias genéticamente iguales para su estudio. -

EXPERIMENTO DE LEDERBERG Consiste en aislar cepas auxótrofas mediante la técnica de placa réplica. Para ello, primero se siembran las bacterias en un medio completo, donde crecerán tanto auxótrofos como protótrofos, y después se transfieren unas pocas células de la placa original a dos placas nuevas, una con leucina y otra sin ella. De esta manera, las

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bacterias que crezcan en el medio con leucina pero no en el que no la tiene serán auxótrofas. 4. CONJUGACIÓN: El experimento que demostró que se producía recombinación en las bacterias es el que realizaron Lederberg y Tatum. Para ello utilizaron dos cepas bacterianas Y10 (thr-, leu- y thi-) y Y24 (bio-, phe- y cys-). Durante el experimento sembraron juntas las dos cepas en una placa con medio mínimo y cada una por separado en una placa también con medio mínimo. Tanto la Y10, como la Y24 por separado no crecen en un medio mínimo, pero juntas sí crecen algunas colonias. La única explicación posible a esto es que se producía recombinación entre ambas cepas. Sin embargo, no se sabía exactamente cómo se producía. Para ello, Bernard Davis construyó un tubo en forma de U, dividido en dos compartimentos por medio de un filtro de poros finos. Este filtro permitía el paso del medio líquido pero no el paso de bacterias. Se colocaron las cepas auxótrofas una a cada lado del tubo y se permitió que el medio fluyera de un lado a otro. Pese a las horas de incubación, no hubo intercambio genético entre las cepas, lo que sugirió que el intercambio de genes requería el contacto físico entre bacterias.

El contacto entre las bacterias se establece por el medio del pilus de conjugación. La presencia de los pilus está determinada por un gen, el factor de fertilidad (F+). Las bacterias que lo poseen son donadoras y las que no, son receptoras. En 1950, Cavalli-Sforza aisló a partir de cepas F+ bacterias que presentaban frecuencias de recombinación 1000 veces superiores a las que se denominaron Hfr. Estas cepas contenían el factor F integrado en el cromosoma bacteriano. Jacob y Wollman realizaron cruzamientos entre cepas Hfr y F- e interrumpieron la conjugación a intervalos de tiempo, comprobando que: - Cada cepa Hfr transfería su material genético a la F- en un orden determinado - La transferencia era secuencial y ordenada - Las bacterias receptoras seguían siendo F-, ya que el factor F se rompe durante el comienzo de la transferencia de la cadena y vuelve a unirse si se transfiere toda la cadena, lo cual es bastante improbable, ya que casi todas las bacterias que se conjugan se separan antes de que la transferencia del cromosoma haya sido completa. Esto permitió construir un mapa genético en el que los genes están separados por minutos en lugar de unidades de recombinación. La cantidad de cromosoma bacteriano que se transfiere 3

depende del tiempo en el que ambas células permanecen conjugadas. Las cepas Hfr se diferenciaban en el punto de origen de la transferencia y en la dirección de la misma. Una célula Hfr puede convertirse en F’ cuando el factor F se separa del cromosoma bacteriano, llevándose con él genes bacterianos, es decir, si se produce una escisión no limpia. Al recombinar estas cepas con cepas F-, los genes que acompañan a la cepa F’ pueden transferirse a las células F-, lo que da lugar a merocigotos. Este proceso se denomina sexducción. Los merocigotos son inestables, por lo que el resto sobrante de DNA o bien se destruye o se integra en la cepa F- por recombinación. 5. TRANSFORMACIÓN: Requiere, tanto la captación del DNA del medio que rodea a la bacteria, como su incorporación al cromosoma bacteriano o a un plásmido. Ésta puede producirse naturalmente cuando la bacteria muerta se degrada y libera fragmentos de DNA al entorno. Las bacterias que captan el DNA son competentes. La competencia se ve influida por el estadio de crecimiento, la concentración de DNA disponible y la composición del medio. El DNA que capta una célula competente no requiere ser bacteriano. Nunca hay contacto físico entre la célula competente y la célula “donadora”. A medida que el fragmento de DNA ingresa en la célula en el transcurso de la transformación, una de las cadenas se hidroliza, mientras que la otra se mueve a través de la membrana y puede aparearse con una región homóloga e integrarse al cromosoma. Esta integración requiere dos entrecruzamientos, después de los cuales el DNA monocatenario restante se hidroliza. Puede haber zonas mal apareadas o heteroduplexas. Esto se resuelve o bien por reparación o por replicación (unos hijos tendrán un genotipo y otros otro). La transformación también se puede inducir artificialmente. Para ello se han desarrollado cepas bacterianas más competentes que las silvestres. El tratamiento con cloruro de calcio, shock térmico o campo eléctrico vuelve las membranas más porosas y permeables al DNA y además la eficiencia de la transformación puede incrementarse con la utilización de altas concentraciones de DNA. El mapa genético puede trazarse mediante la observación de la tasa a la que dos o más genes son transferidos juntos o cotransformados. Cuando el DNA se fragmenta durante el aislamiento, los genes que se encuentran físicamente próximos en el cromosoma tienen mayor probabilidad de estar presentes en el mismo fragmento de DNA y ser transferidos juntos. Una vez dentro de la célula, el DNA queda incorporado al cromosoma bacteriano por recombinación. Si dos genes se encuentran próximos en un cromosoma, pueden producirse los dos entrecruzamientos a cada lado de ambos genes, lo que les permite formar parte del cromosoma receptor. Si, por el contrario, están distantes, puede haber sólo un entrecruzamiento entre los dos.

La probabilidad, por tanto, de integración conjunta de dos genes aportados por el DNA transformante, es mayor cuanto menor sea la distancia entre ellos.

6. TRANSDUCCIÓN: Hay dos tipos de transducción bacteriana: -

TRANSDUCCIÓN GENERALIZADA: La descubrieron Lederberg y Zinder repitiendo el experimento de Leiderberg y Tatum y se vio que, aunque ambas cepas de Salmonella typhimurium estaban separadas por una membrana, sí se producía un intercambio genético, pues aparecían bacterias protótrofas y las parentales eran auxótrofas para determinados caracteres. Los resultados de posteriores experimentos revelaron que el agente de transferencia era un bacteriófago. Durante el ciclo lítico de reproducción del fago, el cromosoma bacteriano se rompe en fragmentos al azar. En algunos casos, los las cápsulas de los fagos engloban DNA de la bacteria, en vez de su propio material genético (fagos transductores). De esta manera, cuando infectan una nueva bacteria le transfieren el DNA de la bacteria lisada, donde se inserta mediante un entrecruzamiento doble. Estas bacterias se denominan transductantes.

No todos los fagos son capaces de transducir debido a que es un episodio extraño que requiere que el fago degrade el cromosoma bacteriano, que el empaquetamiento de DNA en la cubierta del fago no sea específico para el DNA del fago y que los genes bacterianos transferidos recombinen con la bacteria receptora. Como la partícula de fago es pequeña, la cantidad de material genético transducido será también muy pequeña.

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Los genes más próximos tendrán más posibilidad de ser cotransducidos, por lo que la frecuencia de cotransducción es inversamente proporcional a la distancia entre los genes. -

TRANSDUCCIÓN ESPECIALIZADA: Requiere la transferencia de genes de una bacteria a otra por medio de fagos, como en el caso anterior, pero en este caso sólo se transfieren los genes cercanos a determinados sitios del cromosoma bacteriano. La llevan a cabo los fagos lisogénicos. Los profagos pueden escindirse del comosoma bacteriano de manera imperfecta y transportar con ellos una porción pequeña del DNA bacteriano adyacente al sitio de la integración del profago. El fago que transporta este DNA lo inyectará luego en otra célula bacteriana en el siguiente ciclo de infección. El ejemplo más estudiado es el del bacteriófago λ, que se integra al cromosoma de E. coli en el sitio de inserción (att). El DNA del fago contiene un sitio similar al att y por un entrecruzamiento simple integra el DNA del fago al cromosoma bacteriano. El profago λ se escinde mediante un entrecruzamiento similar que revierte el proceso. Un error en la escisión puede provocar la escisión de los genes ubicados a ambos lados del sitio att de la bacteria junto con el DNA del fago. En E. coli suele suceder con los genes “gal”. Cuando el fago transductante infecta otra bacteria el gen puede integrarse al cromosoma bacteriano junto con el profago. Los transductantes son inestables y generalmente revierten al estado silvestre, porque el DNA del profago puede escindirse del cromosoma y llevarse el gen introducido. Los estables se producen cuando hay un intercambio entre el gen bacteriano y el del fago mediante un entrecruzamiento doble.

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