Tinciones - Que es una tincion, tipos de tincon y características PDF

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Que es una tincion, tipos de tincon y características ...

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1. Tinciones Fundamentos sobre microscopía óptica Se pueden utiliz Ar colorAntes pA rA teñir lA s célu LA s y fAcilitA r su observA ci ón. Los c olorAntes son compuestos orgÁnicos y cAd A tipo de colorAnte tiene Afinid Ad

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¿Qué es una tinción? Una tinción es un procedimiento para visualizar un tejido, células o microorganismos, y facilitar su identificación al microscopio, el proceso implica el uso de uno o varios colorantes de modo simultáneo o sucesivo. Ventajas:  Aumentar la resolución  Acentuar las características morfológicas  Conservar la muestra.

TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS A) Observación en fresco Son preferibles en las situaciones siguientes: La morfología de la bacteria se altera cuando se desecan o tiñen Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad. Para observar los cambios citológicos que ocurren durante la división celular. Por este método se observan fácilmente algunas inclusiones celulares como vacuolas y materia grasas. B) Observación con tinciones Para observar las características morfológicas de las bacterias Identificación y diferenciación de microbios de misma y diferente especie. OBSERVACIÓN EN FRESCO Preparación en fresco simple

OBSERVACIÓN CON TINCIONES

Tinción simple---1 COLORANTE

Tinción diferencial---MÁS DE 1 COLORANTE

Tinción especial--- PARA TEÑIR CÁPSULAS, FLAGELOS Y ESPORAS.

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Las tinciones negativas, colorean el medio que rodea a la bacteria, mientras que esta permanece sin teñir. 1- Las tinciones simples se realizan sobre preparaciones previamente secadas. Sobre un portaobjetos con una suspensión de microorganismos previamente secada y fijada a la llama, se vierte una solución diluida de colorante y se mantiene durante uno o dos minutos; a continuación, se lava varias veces con agua y se seca. Debido a que las células son muy pequeñas, este tipo de preparación suele observarse con aceite de inmersión en la lente objetivo. 2- Tinciones diferenciales 2.1 Tinción de Gram La tinción de Gram requiere la utilización de cuatro soluciones en el siguiente orden: 1. Primer colorante. Es de naturaleza básica y tiene, por tanto, afinidad por estructuras cargadas negativamente, como es el caso de la pared celular de la mayoría de las bacterias. El colorante penetra en la pared celular y la tiñe. El compuesto de este tipo más utilizado es el cristal violeta. Como consecuencia de este tratamiento, tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas aparecerán teñidas de violeta. 2. Solución mordiente. Se combina con el primer colorante y forma un complejo, que es insoluble en el caso de los Gram positivos. Los mordientes empleados suelen ser sales metálicas, ácidos o bases, como, por ejemplo, una solución diluida de Yodo. Este tratamiento no altera la coloración que la muestra adquirió en el primer tratamiento. 3. Agente decolorante. Es un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes, como por ejemplo, etanol-acetona (1:1). Mientras que este tratamiento decolora a las bacterias Gram negativas, no tiene capacidad para disolver el complejo formado en la pared celular de las bacterias Gram positivas, que por tanto, no pierden la coloración en esta fase. 4. Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante. El colorante de contraste más utilizado es la safranina, que tiñe de color rojo. Este tratamiento teñirá solo a las bacterias que han perdido previamente el primer colorante, es decir, a las Gram negativas. 2.2 Tinción de Ziehl Neelsen (ácido alcohol resistencia)

La mayoría de la bacterias se pueden clasificar como Gram positivas y Gram negativas. Sin embargo, para teñir algunas bacterias del grupo de los actinomicetos, como las del género Mycobacterium, se necesitan procedimientos más invasivos. El microbiólogo alemán Robert Koch ideó una técnica capaz de teñir a la bacteria Mycobacterium tuberculosis. Esta técnica se basa en el hecho de que, una vez teñidas con colorantes especiales y a alta temperatura, las células de M. tuberculosis resisten el efecto decolorante de una mezcla de ácido y alcohol. Por ello, este tipo de tinción se llama ácido alcohol resistente y a los microorganismos que comparten estas propiedades tintoriales se les conoce como bacterias ácido alcohol resistente. En la actualidad, se utiliza una modificación de la original que recibe el nombre de los microbiólogos que la describieron: tinción de Ziehl-Neelsen. El ácido alcohol resistencia se correlaciona con el alto contenido en lípidos de la pared celular y con la presencia de un tipo específico de ácidos grasos llamados ácidos micólicos. Esta peculiar

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composición confiere a la célula una alta hidrofobicidad. Para poner de manifiesto el ácido alcohol resistencia en la tinción de Ziehl-Neelsen, se requiere el empleo de las siguientes soluciones: 1.-Fucsina-fenol (carbol fucsina), que cuando se aplica en caliente es capaz de teñir todo tipo de de células bacterianas, incluidas las de Mycobacterium. 2.-El fenol facilita la penetración de la fucsina en la pared celular. 3.-Agente decolorante: Es una solución de ácido clorhídrico (0.36N) en etanol, con un elevado poder de decoloración que, no obstante, es insuficiente para arrastrar la fucsina asociada a la pared celular del Mycobacterium. 4.-Colorante de contraste: azul de metileno, que cumple el mismo papel que la safranina en la tinción de Gram. Tras el tratamiento con fucsina y fenol, todas las bacterias se tiñen de rosa-rojo. Sin embargo, mientras las bacterias ácido-alcohol resistentes no cambian de color cuando se tratan con agentes decolorantes, el resto de bacterias se decoloran y podrán tomar posteriormente el colorante de contraste. En consecuencia, las células de Mycobacterium quedarán teñidas de rosa-rojo y las bacterias ácido alcohol sensibles aparecerán de color azul. PROCEDIMIENTOS I. PREPARACIÓN DE FROTIS CULTIVOS LÍQUIDOS 1. Si el cultivo es líquido tómese una asada y extiéndase sobre el portaobjetos.

1. Frotar el asa en arena contenida en un recipiente de arena con solución desinfectante como se muestra en la siguiente figura. 2. Esterilizar el asa en la flama del mechero. ¡ATENCIÓN! Con el propósito de evitar salpicaduras al esterilizar el asa, luego de realizar el frotis con la micobacteria o cualquier otro material contaminante que chisporrotee al colocar el asa a la flama del mechero (por ejemplo, luego de inocular el tubo de HughLeifson con sello de aceite mineral):

2. Déjela secar al aire. CULTIVOS SÓLIDOS 1. Si el cultivo es sólido, ponga primero una gotita de agua en el portaobjetos con el asa y mézclela con la muestra. 2. Esterilice el asa. 3. Deje secar su frotis al aire. 4. Fije su preparación pasándola algunas veces sobre la flama del mechero, teniendo cuidado de no sobrecalentarla.

I. TINCIONES DIFERENCIALES Tinción de Gram 1. Cubrir su frotis con cristal violeta por un minuto.

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2. Lavar con agua de la llave. 3. Aplicar lugol por un minuto. 4. Lavar con agua y secar rápidamente. 5. Decolorar por de 7 a 8 segundos con la mezcla alcohol-acetona.

2. Lavar con agua. 3. Decolorar con alcohol-ácido hasta eliminar el colorante aproximadamente un minuto. 4. Lavar con agua. 5. Agregar colorante de contraste azul de metileno por 30 segundos. 6. dejar secar y observar con el objetivo de inmersión. II. TINCIONES ESPECIALES

6. Lavar y dejar secar. 7. Contrastar con safranina durante 30 segundos. 8. Lavar con agua y dejar secar. 9. Observar al microscopio a inmersión. NOTA: El tiempo de aplicación de cristal violeta, de alcohol-acetona y la safranina pueden ser modificados a criterio, dependiendo de la maduración de los colorantes y del aspecto que tenga la preparación al microscopio (Fenómeno de añejamiento de los colorantes) Tinción de Ziehl Neelsen 1. Agregar carbolfucsina al frotis calentando a emisión de vapores por 5 minutos.

COLORACIÓN DE ESPORAS La esporulación es un mecanismo especializado de supervivencia que han desarrollado algunos bacilos generalmente Gram positivos como los géneros Bacillus y Clostridium. Las esporas presentan mayor resistencia al efecto letal del calor, desecación, alteraciones químicas e irradiaciones. 1. Hacer un frotis y fijar al calor. 2. Agregar verde de malaquita y calentar la preparación a emisión de vapores por espacio de un minuto, cuidar que no se seque el colorante. 3. Lavar con agua. 4. Cubrir con safranina por 30 segundos. 5. Dejar secar y observar a inmersión.

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COLORACIÓN DE CÁPSULAS La cápsula bacteriana es una estructura laxa semejante a un gel que varía en grosor, densidad y adherencia a la pared celular. Esta cápsula es demostrada por tinciones especiales; la sustancia capsular es un polisacárido o poliurónido relacionado con la virulencia del microorganismo. Técnica de rojo congo 1. Coloque una gota de rojo Congo y K. pneumoniae en un portaobjetos. 2. Hacer una suspensión de la cepa. 3. Fijar. 4. Adicionar mordiente de cápsula por 3 minutos. 5. Lavar con agua. 6. Dejar secar.

PR PRACT ACT ACTICA ICA NO. 5

7. Observar a inmersión. Coloración de gránulos metacromáticos 1. Cubrir el frotis con el colorante de Albert por 5 minutos. 2. Lavar con agua y dejar secar. 3. Aplicar lugol por 1 minuto. 4. Lavar con agua y dejar secar. 5. Observar a inmersión.

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OBJETIVO 1. Conocer el procedimiento para realizar frotis bacterianos y tinciones simples empleando dos tipos de colorantes. 2. Identificar la morfología bacteriana y aprender a distinguir los distintos tipos de agrupaciones. 4. Ser capaz de diferenciar entre bacterias Gram positiva y Gram negativas. 5. Estudiar la morfología y las propiedades tintoriales de las bacterias ácido alcohol resistente. INTRODUCCIÓN La mayoría de las bacterias son transparentes, por lo que suele ser necesario recurrir al uso de tinciones, si se desea observar a estos seres vivos con un microscopio óptico convencional, de campo claro. Las tinciones aumentan artificialmente el contraste entre las células bacterianas y el medio circundante. La tinción que hace uso de un solo colorante se denomina tinción simple. Las tinciones más usadas en Bacteriología requieren previamente que la muestra en estudio se someta al proceso de fijación. Habitualmente, las muestras bacterianas se preparan para ser observadas en forma de frotis, lo que asegura una adecuada separación entre las células y facilita que la tinción posterior se distribuya de manera homogénea. Las tinciones diferenciales se denominan así, porque son capaces de diferenciar estructuras o incluso microorganismos que poseen características superficiales distintas. Este tipo de tinciones requieren el empleo de más de un colorante. La tinción diferencial más empleada en Bacteriología es la tinción de Gram. Esta tinción se llama así en honor

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de Christian Gram, Patólogo danés que la describió por primera vez en 1884, y se sigue usando sin apenas modificaciones y constituye la primera etapa de cualquier proceso de identificación bacteriana. La aplicación de esta tinción permite clasificar las bacterias en dos grandes grupos: las Gram positivas y las Gram negativas. Estos dos grupos poseen características estructurales superficialmente y notablemente distintas.

A) Lee el material correspondiente al bloque 2: Tinciones procedimientos para realizar las diferentes tinciones

e identifica los

B) A continuación, visualiza los videos: 1- Tinción de hongos con Azul de Lactofenol https://www.youtube.com/watch?v=7uQRR5bInxI 2- Tinción de GRAM https://www.youtube.com/watch?v=FceD8FFhuew 3- Tinción de Ziehl Neelsen https://www.youtube.com/watch?v=h83U_DV-sME...