TP, esterilización por filtración y radiaciones PDF

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Desarrollo completo sobre los métodos de esterilización por filtraciones, y radiaciones gamma y ultravioleta....

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Técnicas de Esterilización II Trabajo Práctico Investigar e informar sobre los siguientes temas

Esterilización por radiaciones 1- ¿Qué son las radiaciones gamma?, nociones básicas. 2- ¿Cuál es el mecanismo de acción sobre los microorganismos? 3- ¿Cuáles son las condiciones de esterilización: parámetros críticos? 4-¿Qué tipo de materiales que se esterilizan por este método? 5-Describa radiaciones ultravioletas, poniendo énfasis en el uso de lámparas germicidas. 6- ¿Cómo se valida el proceso de esterilización mediante radiaciones?

Esterilización por filtración 1- Defina filtración. 2-¿En qué consiste la esterilización por filtración? 3-¿Qué tipos de filtros y equipos de filtración se utilizan?, Mencione ventajas y desventajas. 4-¿Qué tipo de materiales se esterilizan por este método? 5- Explique en qué consisten las Cabinas de flujo laminar verticales y horizontales. 6-¿Cómo se realiza la evaluación del control ambiental?

Esterilización por radiaciones. 1-La Radiación Gamma o Rayos Gamma es un tipo de radiación electromagnética, y por tanto formada por fotones, producida generalmente por elementos radiactivos o procesos subatómicos como la aniquilación de un par positrón-electrón. Este tipo de radiación de tal magnitud también es producida en fenómenos astrofísicos de gran violencia. Debido a las altas energías que poseen, los rayos gamma constituyen un tipo de radiación ionizante capaz de penetrar en la materia más profundamente que la radiación alfa o beta. Dada su alta energía pueden causar grave daño al núcleo de las células, por lo que son usados para esterilizar equipos médicos y alimentos. Los rayos gamma se producen en la desexcitación de un nucleón de un nivel o estado excitado a otro de menor energía y en la desintegración de isótopos radiactivos. Los rayos gamma se diferencian de los rayos X en su origen, debido a que estos últimos se producen a nivel extranuclear, por fenómenos de frenado electrónico. Ventajas: •

Escaso daño al material

•

Gran efectividad

•

Procedimiento fácil de controlar: dosis de irradiación (tiempo de exposición)

•

Proceso continuo

Desventajas •

Requiere instalación compleja por lo que es solo aplicable a gran escala y no está disponible en todos lados.

•

La emisión de una fuente de radiación gamma no se puede interrumpir

2- Las radiaciones Gamma esterilizan por Ionización de los contenidos celulares, formación de radicales libres y moléculas excitadas, ionizan átomos y moléculas, esto lleva a la desorganización de enzimas y de DNA.

3- Instalación: •

Fuente

•

Blindaje biológico:

– Celda de irradiación – Entrada y salida de productos – Almacenamiento de la fuente en pozo de agua de 4 m de profundidad. •

Sistema de movimiento de materiales: debe asegurar que todos los productos reciban la misma dosis.

Controles: •

Dosímetros

•

Indicadores biológicos: esporas de Bacillus pumilus. Su empleo es obligatorio cuando las dosis son inferiores a 25 kGy.

•

Protección del personal: se lleva a cabo mediante dosímetros (indicadores fisicoquímicos): elementos coloreados, cuyo color aumenta linealmente con la dosis de radiación absorbida.

El material se procesa cuidadosamente y se organiza en una configuración que cumpla las necesidades de la instalación de irradiación. Naturalmente, la fuente de cobalto 60 está “siempre encendida” o irradiando (emitiendo) rayos gamma continuamente, así que, como medida de seguridad (la única medida de seguridad) hay una reserva de agua que está justo debajo de la fuente central. Cuando es necesario, la fuente (“core”) es sumergida en una piscina con una barrera de 10 pies entre el núcleo y el personal de servicio. El mejor momento del proceso es el poder ver y ser testigos oculares del “Efecto Cherenkov”. 4-Aplicaciones: •

Material médico quirúrgico: guantes de goma, implantes (válvulas cardiacas), injertos óseos y de tejidos, catéteres, suturas, jeringas, agujas y bisturíes.

•

Antibióticos, vacunas, hormonas

•

Industria alimentaria.

5-Radiacones ultravioletas. Son escasamente penetrantes y se utilizan para esterilizar superficies y el aire en salas y cabinas, y el agua que no la absorbe. Aplicaciones: -

Desinfección de superficies en CBS: disminución de la contaminación de cultivos y de operarios.

-

Desinfección de aire (quirófanos, sala de quemados, de inmunodeprimidos, de animales de experimentación)

-

Desinfección de agua

No penetra superficies sólidas, opacas, vidrios, plásticos, líquidos turbios y materiales empaquetados.

Mecanismo de acción: produce lesiones del DNA letales, formando dímeros de Timina, o modificaciones químicas, como uniones cruzadas entre bases que interfieren en la replicación. La desinfección por radiación ultravioleta es un proceso físico definido por la transferencia de energía electromagnética de una fuente generadora (la lámpara) al material genético celular de un organismo contenido en un líquido, aire o superficie. Los efectos letales de esta energía son los de incapacitar a la célula de reproducirse. La efectividad de la radiación es una función directa de la cantidad de energía (dosis) que es absorbida por los microorganismos a una determina longitud de onda. 6-Validación. Se hace bajo los parámetros de: I-Calificación de la instalación (CI): Se deben describir mediante evidencia documental las especificaciones relacionadas con el empleo del irradiador. II- Calificación operacional (CO): Se debe realizar un estudio con la cámara de irradiación vacía para caracterizar el campo de irradiación con respecto a la distribución de dosis y la variabilidad de la dosis para demostrar que el equipo puede funcionar y suministrar la dosis apropiada, dentro de los criterios de aceptación definidos. a) Selección y empleo, según las normas correspondientes, de un sistema dosimétrico estándar de referencia. b) División del volumen de la cámara de irradiación, considerando su altura y forma geométrica en las diferentes zonas de interés donde serán ubicados los dosímetros. c) Determinación de los tiempos de irradiación de los dosímetros (5 tiempos como mínimo) a partir de la información que se posea del productor de la instalación, acerca del valor de la tasa de dosis absorbida media global de la instalación y del rango de dosis de trabajo del sistema dosimétrico empleado. d) Irradiación de los dosímetros y registro de los valores obtenidos de la dosis absorbida. Los dosímetros incluidos en los grupos correspondientes a cada tiempo de irradiación serán colocados de forma precisa en las posiciones de irradiación prefijadas. Para cada tiempo de irradiación deben ser irradiados tres dosímetros por posición. e) Procesamiento estadístico de los valores obtenidos de la dosis absorbida para cada posición de irradiación, por cada tiempo de irradiación. Los resultados obtenidos de la dosimetría son tabulados en función de sus valores medios, desviación estándar, intervalos de confianza y coeficientes de variación. f) Determinación de la razón de uniformidad (U) para el volumen de irradiación a partir del valor medio de la relación entre los valores máximos y mínimos de dosis absorbida para cada tiempo de irradiación. Los valores obtenidos serán tabulados. g) Determinación de la tasa de dosis. III- Calificación del comportamiento funcional (CCF): El objetivo y las acciones a realizar durante esta etapa son similares a los de la CO, pero con el volumen de irradiación ocupado con el producto al cual le será

validado su proceso de irradiación. Además, a partir de los resultados obtenidos se debe seleccionar un punto dentro de la cámara de irradiación para la ubicación de los dosímetros del control de rutina y determinar la relación entre el valor de la dosis absorbida en esa posición y los valores máximo y mínimo obtenidos dentro del volumen de irradiación. IV- Control rutinario del proceso: Durante esta etapa el patrón (geometría) de carga del producto es el mismo que el empleado durante la CCF y se utiliza un sistema dosimétrico de rutina, aunque también puede ser empleado un sistema dosimétrico estándar de referencia. Los pasos para el control de rutina del proceso de irradiación de un producto determinado son: a) Colocar el producto a irradiar dentro de la cámara de irradiación. b) Ubicar dentro de la cámara de irradiación, en la posición para la dosimetría de control seleccionada durante la etapa de CCF un grupo de dosímetros. Si el número de lotes se encuentra entre cinco y 10, entonces se realiza un solo control. Si el número es superior a 10, entonces se realizará un control por cada diez lotes. c) Después de irradiar el producto de conjunto con los dosímetros durante el tiempo

requerido, se

determina el promedio del valor de la dosis absorbida en la posición de control y se calcula el valor de la dosis absorbida media global recibida por el producto.

Filtración. 1-La filtración es un método de separación física utilizado para separar sólidos a partir de fluidos (líquidos o gases) mediante la interposición de un medio permeable capaz de retener partículas sólidas que permite únicamente el paso de líquidos. 2-La filtración es un procedimiento de esterilización de fluidos en el cual los microorganismos no son destruidos, sino simplemente retenidos por un material filtrante. 3-El material filtrante debe de ser inerte para no reaccionar con los componentes de la solución, presentar resistencia mecánica y tener un tamaño de poro menor que los microorganismos que deben ser retenidos. Tradicionalmente se usan filtros de nitrocelulosa desechables con tamaño de poro de 0,45 o de 0,22 micras. Tipos de filtro: •

Filtros de profundidad: En este tipo de filtros la retención de partículas se produce por una combinación de absorción y efecto tamiz. Consisten de un material fibroso o granular prensado, plegado, activado, o pegado dentro de los canales de flujo (fibras de papel o vidrio de borosilicato). Dado que el material de filtración está dispuesto al azar en una lámina gruesa, los filtros de

profundidad no se obstruyen fácilmente, por lo que se usan como prefiltros para eliminar partículas grandes de suspensiones líquidas (filtros HEPA). •

Filtros de nucleación (Nucleopore): Son películas muy delgadas de policarbonato que son perforadas por un tratamiento conjunto con radiación y sustancias químicas, filtros con orificios muy regulares que atraviesan la membrana verticalmente, funcionan como tamices, evitando el paso de toda partícula con un tamaño mayor al del poro. Tienen menor cantidad de poros, la velocidad de flujo es más baja y se produce atascamiento. Se usan en microscopía electrónica de barrido para concentración y visualización.

Equipo:

Filtracion de aire: •

FILTRO HEPA (High Efficiency Particulate Aire): Laminas de borosilicato que atrapan partículas y agentes infecciosos de más de 0,3 micras con una efectividad del 99,97% (efecto Tamiz).

•

FILTROS ULPA: retienen partículas de entre 0,1 y 0,2 micras. Eficiencia de 99.99%

Desventajas: La filtración tiene la desventaja de que es ineficaz con determinados microorganismos, como los virus o los micoplasmas. Los primeros son mucho más pequeños que el tamaño del poro, por lo que no son retenidos. Los segundos son pleomórficos ya que carecen de una pared de peptidoglicano y pueden adaptarse al tamaño de poro, por lo que tampoco son retenidos

Ventajas: los métodos de filtración permiten esterilizar aceites, pomadas, soluciones oftálmicas, aire, etc. rápidamente. No alteran las características organolépticas de las suspensiones 4- La filtración sólo puede ser utilizada con fluidos, sean líquidos o gaseosos. Se suele utilizar con soluciones cuyos componentes sean termolábiles y por lo tanto no pueden ser esterilizadas en el autoclave, por ejemplo, soluciones concentradas de azúcares, de urea, vitaminas, factores de crecimiento, soluciones oftálmicas e intravenosas, radioisótopos, vacunas, hidratos de carbono, medios ricos para cultivos celulares, soluciones de antibióticos y vitaminas. 5- Las cabinas de flujo laminar son recintos que emplean un ventilador para forzar el paso del aire a través de un filtro HEPA (acrónimo del término anglosajón High Efficiency

Particulate Air), barriendo la

superficie de trabajo. Su función es la de mantener un área libre de partículas, especialmente de posibles contaminantes (bacterias, levaduras,…) que puedan acceder al cultivo. Esto se consigue mediante los dos sistemas de barrera de aire y filtro que impiden la salida de contaminación. Las barreras de aire se crean permitiendo que éste fluya en una sola dirección y a una velocidad constante dando lugar a una verdadera “cortina” de aire que se conoce como flujo de aire laminar. Es, por definición, un flujo con ausencia de turbulencias. Los filtros tienen como finalidad atrapar las partículas contenidas en este flujo de aire y los empleados habitualmente son los HEPA, que retienen con una eficacia del 99,97% partículas de hasta 0,2 micras de diámetro. El filtro puede estar ubicado en el techo de la cabina (flujo laminar vertical), o en una de sus paredes (flujo laminar horizontal): -Las cabinas de flujo laminar horizontal son muy adecuadas para una buena protección del producto, pero no son adecuadas para el trabajo con materiales peligrosos o con algún tipo de riesgo pues el operador queda completamente expuesto.

– Las cabinas de flujo vertical, más sofisticadas, se segura una buena protección del producto, y, dependiendo de su diseño se puede asegurar una protección total del operador. Son por ello más adecuadas para el trabajo con agentes peligrosos.

Estas cabinas ofrecen protección únicamente al material que se maneja en su interior, pero nunca al operador, por lo que no son recomendables para el trabajo en un Laboratorio de Microbiología Clínica. Son, sin embargo, un instrumento de trabajo imprescindible en las denominadas “zonas limpias”. 6-Controles FÍSICOS Cabinas Flujo Laminar: •

Test de Fugas: integridad del filtro (periodicidad anual o después de reparaciones).

•

Test Velocidad de salida del filtro (periodicidad anual o después de reparaciones).

•

Test de Partículas (periodicidad anual o después de reparaciones).

•

Test de Humos (periodicidad anual o después de reparaciones).

•

Panel de Indicadores (periodicidad diaria).

•

Luces U.V/Fluorescente (periodicidad diaria).

Control microbiológico de cabinas: Periodicidad mensual, durante el funcionamiento rutinario de la sala y, adicionalmente, siempre después de que se produzcan las siguientes circunstancias: 

Validación de sistemas.



Acción de mantenimiento, como cambio de filtros.



Ejecución de una acción correctora.



Periodo >1 mes de inactividad de la sala.

Certificación de cabinas de flujo laminar: Se determinan las condiciones de las Barreras Primarias mediante la realización de las pruebas de campo de las cabinas de seguridad biológicas (CSB), con el fin de asegurar el balance entre los flujos de aire que ingresan y los que se extraen. Se determinar la distribución de aire sobre la superficie de trabajo y se verifica la integridad de ella; mediante la: •

Medición de velocidad descendente en Interior de la CSB (Downflow Velocity)

•

Medición de velocidades en la entrada de la CSB (Inflow Velocity) o Face Velocity

•

Determinación de los porcentajes de recirculación (100% caudal al interior de la CSB)

•

Determinación de los porcentajes de inyección al interior CSB.

•

Niveles de Iluminación y Luminancia.

•

Radiación UV-C

•

Medición de ruido, descrito en el IT-5-005

•

Medición de partículas no viables, descrito en el IT-5-006

•

Medición de partículas viables, descrito en el PR-5-005

Técnicas de esterilización II. Trabajo práctico final. Santillán Juan Martín....