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Cours sur les peptides...

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Chimie ~ Chapitre 1

PEPTIDES Pagès Objectifs du cours Connaître : ▪ La structure et les propriétés de la liaison peptidique ▪ Les méthodes de séquençage des peptides ▪ Les méthodes de séparation des peptides Savoir: ▪ Retrouver le point isoélectrique d’un peptide ▪ Clivage des peptides

I. Définitions ▪ Les peptides contiennent essentiellement des acides aminés de la série L (il y a une évolution sur le plan moléculaire depuis des milliards d’années qui a conduit à la série L,…) : polymères d’aa. ▪ Masse : < 5000 Da (au-delà c’est une protéine) ▪ Taille : environ 10 à 20 aa (variable pour certains ouvrages donc osef nombre exact) ▪ Il n’y a pas de structures secondaires canoniques (mais certains se structurent en hélice α car celles-ci peuvent être formés de moins de 10 aa : peptide anti-infection/antiseptiques  début d’hélice α ▪ Sens de synthèse biologique : N-term/…./C-term [biologie = série de règles générales avec un cas particulier]

▪ Intérêt biologique: -

le BNP (Brain Natriuretic Peptid) : isolé à partir de cerveau de porc, ayant une fonction dans la physiologie cardiaque, il permet de maintenir la volémie en faisant sortir le sodium, régule le volume sanguin, sécrété par le coeur, régulation des concentrations ioniques

-

Hepcidine : synthétisé par le foie, « insuline du fer », permet de réguler la captation du fer par le TD, a de nombreux récepteurs

-

Hormones hypophysaires : c’est particulier car ces peptides sont synthétisés sous la forme d’une protéine, leur clivage par des enzymes dans l’hypophyse va générer des peptides

▪ Si plus de 20 acides aminés : polypeptide ou protéine

II. La liaison peptidique ▪ La liaison peptidique est amide, elle s’établit entre : •

le carbone de la fonction carboxyle d’un aa (de la glycine dans cet exemple)

•

et l’azote de la fonction amine d’un aa (de l’alanine dans cet exemple).

▪ Une liaison covalente va s’établir, cela forme un amide ayant une structure particulière. ▪ Cela libère une molécule d’eau par la condensation ▪ Ce qui permet de former la liaison peptidique.

1. Formation de la liaison peptidique ▪ Formation de la liaison peptidique in vitro (chimiquement) : Méthode peptidique de

de C-

▪ Formation de la liaison peptidique in vivo

▪ Se fait au moment de la traduction ▪ Ribosome : site catalytique de formation de la liaison peptidique

Merrifield : synthèse term vers N-Term.

▪ Cette formation est faite dans le cytoplasme des cellules chez les êtres vivants et est catalysée par le ribosome (constitué de 2 sous unités) : il y a lecture à partir d’un codon initiateur (AUG=Met), il y a élongation de chaîne, l’ARNt est lié à la chaîne en cours d’élongation, il y a un 2 ème site où un anti-codon se fixe… Elle nécessite de l’énergie. ▪ Les ribosomes sont constitués de protéines et de ribonucléosides (ribonucléoprotéines) = protéines + ARN.

▪ 4 partenaires dans cette réaction : • Ribosome, • ARNm : étant le modèle exposant les codons ou se fixent les ARNt • ARNt : portent un anticodon qui reconnaît une liaison de Watson et Crick, une liaison par l’ARN, l’ARNt a la particularité de fixer un aa ➢ ARNt sur le site P est lié à une chaine peptidique en élongation, catalyse la formation de la liaison peptidique ➢ ARNt sur le site A lie un AA unique → Formation de la liaison peptidique à l’intérieur du site catalytique.

▪ La chaine s’allonge à partir d’une extrémité N-term vers C-term car la réaction se produit entre : • l’amine portée par l’ARNt du site A • la fonction acide carboxylique qui est portée par l’ARNt lié au site P • Une élongation s’est produite et il y a une libération de l’ARNt au site P qui est délié de la chaine peptidique. • Transfert de l’ARNt du site A vers le site P pour libérer cet ARN.

2. Propriétés de la liaison peptidique a) Structure de la liaison peptidique ▪ Cette liaison est particulière car elle se situe dans un plan, le plan de l’amide dans lequel on peut placer : •

le carbone α,

•

le carbone qui porte C-term,

•

l’atome d’azote du 2e aa

•

et le dernier C α

▪ Les autres atomes sont hors du plan (O, H, R,…).

▪ Angle Oméga ω : angle de rotation autour de la liaison entre la fonction C-term du 1 er aa et la fonction azote du 2e aa => permet d’acquérir la structure tridimensionnelle

b) Sa distance inter-noyaux de 1,32 Å ▪ Les distances entre les atomes dans des liaisons covalentes simples varient de 1,4 à 1,5 Å ▪ Ici 1,32 Å : habituellement dans des doubles liaisons entre les atomes de carbones. Les atomes sont donc très proches dans cette liaison. Cela donne une propriété de solidité à la liaison peptidique. C’est une liaison très stable, c’est pour cela qu’elles ont été sélectionnées au cours de l’évolution. Elle a permis la pérennisation, le maintien de cette structure. ▪ Elle est plus forte qu’une liaison covalente et s’apparente à une double liaison.

c) Sa polarité ▪ La liaison peptidique est polaire. ▪ L’hydrogène lié à l’azote est parfois appelé hydrogène des protons : il est électropositif. ▪ Un dipôle se forme entre l’oxygène électronégatif (souvent O) (potentiel = -0,42 mV) et l’hydrogène électropositif (souvent N) (+0,2 mV). ▪ Le nuage électronique est plutôt du côté de l’atome d’oxygène. → Cela contribue à la petite distance entre l’azote et le carbone. La liaison peptidique est comme une double liaison par tautomérie.

2.1- Structure isomérique de la liaison peptidique ▪ Théoriquement on a Omega ω : 0° ≤ω≤ 180°. ▪ L’angle à 0° : est très peu observé car si on avait cet angle, les chaines latérales portées par le carbone α des deux aa seraient dans une proximité physique importante (en CIS). Quand on parle de CIS on se réfère à la double liaison. Ici c’est défavorisé car il y a un encombrement stérique (manque de place induit par des chaines relativement proche). ▪ 180° : la position TRANS est plus fréquente et est majoritairement observée. Il y a un encombrement stérique qui est moins important pour les chaînes latérales.

2.2- Structures particulières La configuration Cis existe : ▪ Dans les liaisons impliquant l’azote de la proline (aa cyclique), cycle pyrrolidine ω = - 65°, la configuration cis n’entraîne qu’à peine plus

d’interférence stérique que la configuration trans. En effet la chaine latérale de la proline est directement impliquée dans le cycle (liée à N) et n’est pas stériquement gênée. ▪ 10% des résidus de proline d’une protéine ou d’un peptide se trouvent en configuration cis. ▪

Les prolines permettent de changer l’orientation des chaines peptidiques en formant des coudes « proline » dans les protéines.

3. Géométrie de la liaison peptidique ▪ L’aa se trouve à la jonction de deux plans pouvant tourner l’un par rapport à l’autre autour de chacune de ces liaisons. Il y a alignement de deux plans liés par le carbone alpha et pouvant tourner, engendrant la structure tertiaire des protéines… Rotation avec angle Phi et Psi.

a) Détermination des angles possibles ▪ Phi Φ : angle de rotation autour de la liaison entre un carbone α et un atome d’azote (de N-H par rapport à Cα-N) ▪ Psi Ψ: entre ce même carbone α et la fonction acide carboxylique (de C=O à Cα-C)

Il y en a autant qu’il y a de liaisons peptidiques. Va donner la souplesse aux protéines et aux peptides ; va leur permettre d’acquérir leur structure tridimensionnelle. Attention ces angles ne font pas partie de la liaison peptidique !

▪ Les angles phi ϕ et psi ψ peuvent prendre toutes les valeurs entre 0 et 360°. ▪ En fonction des angles phi Φ et psi Ψ, il y a un encombrement stérique particulier qui conditionne la structure de la protéine. Comme pour l’angle ω, des valeurs d’angles sont plus ou moins favorisées.

Diagramme de Ramachandran ▪ Zone vert foncée : positions les plus favorables au moindre encombrement stérique entre les chaines latérales et les atomes portés par le carbone portant la fonction acide carboxylique. ▪ Zone vert pale : structures relativement favorables. ▪ Zone blanche : cela ne veut pas dire qu’on ne les observe pas mais ces liaisons sont défavorisées de par l’encombrement stérique entre les chaînes latérales et les autres atomes de la molécule

▪ Structures idéales comprises entre : • -180 ≤ Φ ≤ -60°

• 100° ≤ Ψ ≤ 180°

III. Propriétés des peptides ▪ Charges positives : du côté N-term (pKa à pH physiologique, on remarque que ces fonctions sont toujours ionisées) ▪ Charges négatives : du côté C-term (porte deux oxygènes qui ont la capacité de libérer un proton)

▪ En fonction des chaines latérales, on a des possibilités d’avoir des peptides ayant des charges portées par les aa entre ces deux extrémités. ▪ Une convention veut qu’en absence de précision on considère que l’aa de gauche est en N-Term et à droite on aura alors C-Term, on respecte le sens de lecture occidental.

1. Détermination de la composition primaire des peptides ▪ Composition primaire : composition en aa ▪ Séquence : ordre des aa en commençant par N-Term et en allant vers C-Term ▪ La composition de la séquence peptidique ne donne pas la séquence, l’ordre des aa impliqués.

1) Méthodes chimiques ▪ Hydrolyse acide : -

On va rompre des liaisons peptidiques

-

Obtenue par l’utilisation d’acide chloridrique (HCl 6N à 110°C pendant 24-72h)

-

Par hydrolyse acide on obtient un mélange d’aa, qu’on peut séparer par chromatographie.

-

Chromatographie : migration des aa dans un champ électrique pour les séparer les uns des autres

-

Séparation des aa par chromatographie seulement si sa concentration excède un 1pmol (permet de voir la coloration). Spécificité de cette chromatographie = 10-12 mol

-

Attention: ➢ Les amides deviennent des acides : Asn (N) donne Asp (D) et Gln (Q) donne Glu (E) ➢ Trp (W) est souvent détruit (on utilisera l’hydrolyse alcaline) ➢ Cys (C) est aussi altérée : évaluation préalable (notament lorsqu’elle forme des ponts disulfures)

▪ Hydrolyse alcaline : (parfois marche – bien)

-

Soude NaOH 2-4N, la soude est plus active que l’acide chlorhydrique

-

Permet d’obtenir Trp (W)

-

Pour déterminer la présence de Gln et Asn on utilisera d’autres méthodes… Tout ça sert à déterminer la composition des peptides.

2) Séquençage des peptides On obtient l’ordre des liaisons entre les peptides en plus de la composition primaire.

a) Méthode de Sanger ▪ On fait réagir le peptide avec le DinitroFluorobenzène DNF (molécule activatrice) ▪ Le fluor attaque l’atome d’azote pour établir une liaison (on substitue un atome d’hydrogène du DNF) ▪ Le peptide est donc lié de manière covalente à un DN (le fluor est parti), on produit une hydrolyse acide ou basique : plutôt douce... ▪ On réalise la chromatographie. ▪ On voit les mêmes aa mais il y en a un qui aura une liaison avec le DNF, ce sera celui qui était en N-term ! ▪ Si on répète l’opération en enlevant un aa à chaque fois, on obtient la structure du peptide. → Méthode lente, pas automatisable et pas facile à mettre en œuvre (peu utilisée, remplacée par la méthode d’Edman)

b) Méthode d’Edman ▪ On utilise le Phénylisothiocyanate. ▪ Il va comme le DNF réagir avec l’atome d’azote en N-term pour former le phénylisothiocyanate-aminoacide. ▪ Un doublet d’un atome d’oxygène de l’aa en position amino-terminale attaque l’atome d’azote porté par le cycle du Phénylisothiocyanate. ➔

Réaction spontanée

▪ On libère un cycle : phénylthiohydantoïde-aminoacide ▪ On libère le peptide moins l’acide aminé N-term ▪ On décroche chacun des aa en N-term. ▪ On procède mole par mole. ▪ Chromatographie : permet de séparer le peptide moins un aa et le phénylthiohydantoïde-aminoacide que l’on peut identifier. ▪ On répète l’opération en ajoutant une mole à chaque fois

→ Technique préférentielle mais se limite à une dizaine d’aa au maximum Ces techniques de séquençages peuvent être difficiles à réaliser pour des séquences trop grandes. On utilisera plusieurs techniques pour plus de certitude : hydrolyse acide, méthode d’Edman et coupures enzymatiques.

1) Autres méthodes de clivage des peptides ▪ Il y a des protéines pouvant cliver une liaison ▪ Peptidases : enzymes pouvant cliver les liaisons peptidiques • Exopeptidase: ne peut agir sur une liaison peptidique que si elle implique une extrémité. ➢ Soit on fixe l’enzyme sur un support et on fait passer le peptide de façon à ce qu’il n’y ait qu’une seule coupure ➢ Soit on passe rapidement le peptide dans la solution -

Aminopeptidase: NH3+

-

Carboxypeptidase: COO-

➔ On connaît ainsi les extrémités.

• Endopeptidase: peuvent agir au milieu de la chaine, 3 enzymes protéiques, agit de manière spécifique : -

Trypsine: coupe du côté carboxyle des résidus basiques (R : Arginine, K : Lysine) sauf l’histidine

-

Chymotrypsine: coupe du côté carboxyle des résidus aromatiques (Trp, Phe et Tyr) W : tryptophane, Y : tyrosine, F : phénylalanine

-

Protéase Staphylococcique: coupe du côté carboxyle des résidus acides (Asp et Glu) (E : Glutamate, D : Aspartate)

▪ Méthode Chimique: CNBr (bromure de cyanogène) : clive uniquement du coté carboxyle des méthionines (M/Met)

1) Autres techniques de détermination de la séquence primaire ▪ Clonage du gène (très utilisé en 2015): -

Structure du gène et séquençage de l’ADN donc on peut connaître la structure des peptides (le génome humain a été séquencé pour la première fois en 2001)

-

On cherche des nouveaux peptides (qui pourraient faire de nouveaux antibiotiques)

-

Prédire la présence d’un peptide.

▪ « Spectrométrie de masse »: séparation en phase gazeuse de molécules ionisées en fonction de leur rapport masse/charge (m/z), il en existe de nombreuses :

-

ESI-MS (ElectroSpray Ionization-Mass Spectrometry): ➢ On projette des rayonnements gamma ou autre… sur un peptide fixé sur un support. ➢ On mobilise les produits de ce peptide irradié (fragments de peptide). ➢ En fonction des caractéristiques du peptide on va pouvoir identifier le peptide. ➢ On accélère les fragments chargé électriquement, on regarde ensuite la façon dont ils se déplacent dans le tube. ➢ La vitesse à laquelle ils vont venir sur le récepteur va dépendre de leur masse et de leur charge électrique.

-

MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight): ➢ Clivage d’un peptide par la trypsine ➢ MALDI : on bombarde l’échantillon avec un faisceau laser qui opère une ionisation des fragments de cristal ➢ Les fragments ionisés sont accélérés dans un tube sous vide (une chambre) et migrent à une vitesse proportionnelle à leur masse et à leur charge pour arriver à un détecteur TOF ➢ On compare le temps de vol avec une banque de données (peptides à pH différents pour des différenciations différentes). On peut synthétiser à peu près tous les types de peptides que l’on peut retrouver.

-

Chaque bande peut être reconnue, on va pouvoir reconstituer la séquence.

-

C’est le même principe que pour le clivage enzymatique, on précoupe donc le peptide avec des enzymes et on va obtenir des séquences différentes

1) Améliorer la résolution de la spectrométrie [osef nom  principe : on ionise la chaîne latérale pour sensibiliser] ▪ Conversion des lysines en homo-arginines ▪ On modifie l’arginine par l’action de l’O-méthyl-iso-urée qui va cliver l’arginine. Cette molécule sera plus facile à ioniser, elle aura des caractéristiques particulières, cela permettra d’identifier les peptides qui contiennent de l’arginine → L’homo-arginine s’ionise mieux que la lysine.

2. Les méthodes de séparation des peptides ▪ MALDI-TOF

▪ L’électrophorèse: -

Séparation selon :

• la taille : c’est le plus facile pour séparer • la charge : pour déterminer le pI. • la masse et la charge = chromatographie bidimensionnelle ▪ Les chromatographies… -

Les méthodes physiques : spectrométrie de masse,…

1) Électrophorèse en SDS Rôle du SodiumDodécylSulfate: ▪ Le SDS se lie aux peptides (et aux protéines) par des interactions :

-

Hydrophobes

-

Une molécule par acide aminé

▪ et leur donne une charge globale négative quel que soit le pH (plus le peptide est grand plus on a de charges). La charge globale est négative, le nombre de charges est proportionnel à la taille, la migration également. ▪ Séparation des peptides en fonction de leur taille (on peut trouver leur masse). Principe : ▪ Deux cuves avec deux plaques de verre avec un espaceur de 1 mm, entre ces deux plaques on a coulé un gel (acrylamide, agarose…). ▪ Dans ce gel un électrolyte peut passer en fonction de son maillage. En fonction de la densité du gel on peut séparer les gros des petits peptides. ▪ On met le mélange en haut dans les puits puis on applique le champ électrique. On a alors une séparation des peptides selon leur taille : •

Les gros peptides restent bloqués dans le gel

•

Les petits peptides passent rapidement

▪ Pour les voir il faut les colorer au ronge ponceau par exemple.

La migration dépend de la taille/masse mais SURTOUT de la structure du gel.

2) Structure des gels d’électrophorèse ▪ Agarose = polymère de sucres ▪ Acrylamide + Méthylène bis-acrylamide = GEL ▪ La proportion de ces molécules va donner la réticulation : •

plus on met de bis-acrylamide plus cela est serré,

•

plus on sépare les petits peptides.

Plus résolutif plus il sépare des peptides de petites tailles et inversement.

3) Détermination de la masse moléculaire ▪ La migration n’est pas un phénomène linéaire. ▪ Si on veut une droite, il faut un papier semi-logarithmique (où on met directement la masse). ▪ On utilise une référence (mélange de peptides dont on connaît la masse de chaque peptide par exemple). Me :Masse échantillon ▪ Plus le peptide est PETIT plus il migre LOIN. Masse et taille c’est presque pareil.

4) Révélation des peptides Ils sont incolores donc on utilise des colorants : ▪ Bleu de Coomassie ▪ Nitrate d’argent: Très sensible ▪ Rouge ponceau ▪ Réaction Ag/Ac (cf: Western blot = immunoblot)

3. Propriétés ioniques ▪ C-term ( + ) et N-term ( - ) peuvent être ionisés à pH physiologique ▪ A pH physiologique, il y aura des AA ionisés et d’autres pas. ▪ Un peptide se définit, aussi, par son pI (point isoélectrique) : somme des charges globales nulles ▪ Le pI dépend :

•

de la charge des groupes latéraux

•

des fonctions C-term et N-term

▪ Attention: Les pKa des fonctions, au sein d’un peptide, ne sont pas exactement les mêmes que ceux des acides aminés pris en isolements. ▪ Pour connaître le pI de façon théorique, on doit connaître la séquence du peptide en question ; la composition ne suffit pas car on doit connaître les extrémités Nterm et Cterm de notre peptide qui porte des charges et qui sont donc importants dans le calcul de ce pI. ▪ La meilleure façon est expérimentalement mais possibilité de calcul théorique

1) Méthode expérimentale : Détermination par Iso-électrofocalisation ▪ Tube avec un gel (pas stringent donc taille moindre des peptides) ▪ On a un gradient de pH. ▪ On dépose l’échantillon qui contient un peptide unique ou soit un mélange de peptides. ▪ On applique un champ électrique, les peptides migrent dans le gel ▪ Ils vont ...