UE1 - Cours 13 - Les protéines (Pages) . PDF PDF

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Les protéines par pr pages...

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Les Protéines Connaître : Les différentes structures des protéines Les mécanismes d'acquisition des structures Les Immunoglobulines Savoir : Déterminer le rendement d'une purification Calculer l'affinité d'un ligand pour une protéine

Etymologie : JJ Berzélius et GJ Mulder 1838 Du fait du caractère essentiel des "protéines" pour la bonne fonctionnalité des activités biologiques : (protéion) : qualifie un personnage de première place : ça vient du latin

1) Définitions : Structure primaire : Enchainement des acides aminés Structure secondaire : Organisation de domaines protéiques Structure tertaire : Organisation tridimensionnelle de la protéine fonctionnelle (peut etre fonctionnelle quand elle est sous la forme d'un monomère ou après clivage d'un dimère Structure quaternaire : Association de plusieurs chaines codées par des gènes différents Modifications post-traductionnelles : Phosphorylation, glycosylation ... 1.1) Structure primaire :

1.2) Structures secondaires :

Les brins bêta peuvent être sens ou antisens Les boucles ne sont pas considérées comme des structures secondaires 1.3) Structures supérieures :

Hélice α retrouvée dans une chaine de myoglobine (= 8 hélices α) : C'est la structure tertiaire. On voit ensuite la structure quaternaire : molécule d'hémoglobine composée de 4 chaines de globines (2 α et 2 β) 1.4) Structures particulières :

Dans certains cas : que des hélices alpha forment une structure quaternaire fonctionnelle (dimérisation de la structure secondaire)

2) Détermination de la structure des protéines : Détermination de la structure tridimensionnelle : Composition en acides aminés : Traitement informatique Interactions au sein de la séquence primaire Interactions avec l'environnement Modifications post-traductionnelles

2.1) Interactions structurantes A| Liaisons hydrophobes :

Acides aminés aliphatiques et aromatiques ΔG = 20-30kJ.mol-1 B| Ponts di-sulfures : uniquement entre les cystéines = liaison covalente

Réduction possible : DTT (Dithiotrétol) ou β-mercapto-éthanol

Réduction des ponts di-sulfures :

C| Liaisons électrostatiques : change selon le pH

Exemple : ponts salins Liaison forte : ΔG = 60-100 kJ.mol-1 D| Liaison hydrogène :

permettent la stabilisation des hélices α et des feuillets β (mais pas pour les brins β)

ΔG = 10-40 kJ.mol-1 E| Liaison de coordinance :

ce sont les doublets d'un atome N qui sont échangé avec des cases libres sur l'atome Fe : équivalent de liaisons de covalence.

2.2) Diagramme de Ramachandran détermine la structure des protéines dans l'espace.

3) Les structures secondaires : Lorsque plusieurs résidus consécutifs ont les mêmes valeurs de Ψ et Φ = répétitions, il devient possible de déterminer une structure Pour la glycine : plus grande souplesse car pas de chaine latérale Pour la proline : l'angle Φ est constant : - 65°

L'hélice du collagène n'est pas une hélice α

3.1) Les hélices

3.1.1) Caractéristiques des hélices α :

Nombre d'acide aminé par pas : 3,6 Formation de liaisons hydrogènes : 2,86 A entre un atome d'oxygène et l'hydrogène de l'azote du 4ème acide aminé faisant suite (13ème atome) Les charges peuvent empêcher la formation des hélices : Glu à pH = 7 Nombre moyen d'acide aminé par hélice : 5 à 40 (10 en moyenne)

3.1.2) Eléments de stabilisation des hélices α :

Présence d'acides aminés chargés (+ ou -) : tous les 3 acides aminés Idem pour les acides aminés aromatiques Grande quantité de liaisons hydrogènes 3.1.3) Propriétés des hélices :

Formation d'un dipôle entre les deux extrémités de l'hélice Hélice amphotère (chaine latérale d'AA chargé et réparties avec un côté électronégatif et un côté électropositif) ou amphiphile amphipathique (interaction avec un environnement hydrophile d'un côté et avec un environnement hydrophobe de l'autre)

3.1.4) Hélice du collagène :

Hélice gauche Ψ 153° et Φ -51° 3 résidus par tour Répétition : Gly-X-Y Glycine : 30% X:Pro et Y:HO-Pro (= hydroxyproline) pour un total de 25% Pas de liaison hydrogène intra-chaîne La cohésion provient de l'enroulement de trois chaînes

Hélice induite par un enchaînement de prolines

Collagène = protéine des tissus de soutien 3.2) Les brins et feuillets plissés β : Chaîne polypeptidique dont les acides aminés sont non enroulés Les acides aminés s'organisent en formations instables isolément Stabilisation des brins au sein d'un feuillet composé de chaînes "parallèles" Si Ψ + 135° et Φ - 139° : liaisons hydrogènes possibles entre les chaines

3.2.1) Feuillet anti-parallèle :

3.2.2) Feuillet β parallèle :

1)

Thiorédoxine : maintien de l'état de réduction dans les cellules Elle contient des élices alpha, des brins bêta et un pont di-sulfure : entre deux brins bêta ont a des boucles (=coudes) = domaine de liaison (entre des brins beta ou entre des hélices alpha), ils ont entre 2 et 20 AA

3.2.3) Boucles et coudes :

Ce sont les domaines de liaison au sein des protéines 2 à 20 résidus Permettent les changements d'orientation dans l'espace Souvent exposés à la surface des protéines Les groupements CO ou NH n'établissent pas obligatoirement de liaisons hydrogènes internes 3.2.3.1) Les différents types de coudes :

Coudes γ : trois résidus, les deux extrêmes sont liés par une liaison hydrogène. Les coudes β : * Quatre résidus * 1 et 4 forment une liaison H * Connectent souvent deux feuillets * Huit types différents 3.2.3.2) Coudes VI :

caractérisé par la présence de proline à l'angle du coude (induit la formation du coude)

6% des prolines au sein des protéines globulaires Les boucles sont beaucoup moins structurées que les coudes. 3.2.4) Les doigts de zinc : Liaison à l'ADN ou à l'ARN

Motif le plus commun : Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His (Type C2H2 : on les retrouve dans les protéines qui clivent les acides nucléiques) Lie l'ADN et l'ARN Autres motifs : C2H2 : facteurs de transcriptions C3HC4 : ou motif RING. RAG1, protéine de recombinaison entre les séquences d'ADN. Elles permettent la diversité des chaines d'immunoglobulines. Ce sont des protéines qui lient l'ADN C2-C2 : récepteurs aux hormones stéroïdiennes. Ce sont des protéines qui lient l'ADN. C6 : fixation de deux atomes de Zn2+

3.2.5) Les motifs EF :

L'ion calcium (Ca2+) est le métal le plus abondant : rôle dans la coagulation, la contraction musculaire... La concentration en Ca2+ peut beaucoup varier : de 50nM à 10µM (très grande concentration) Le rayon ionique du calcium est plus important que celui du Na +, K+, Mg2+. Le Ca2+ établit 6 à 8 liaisons de coordination avec les protéines Interaction avec les acides aminés acides : Asp et Glu, mais aussi l'Asn 3.2.5.1) Structure de la boucle de fixation du Ca2+

Ce sont des liaisons de coordinance qui stabilise la fixation de l'atome de calcium

3.3) Fréquence de localisation topologique des Acides Aminés :

Dans les hélices alpha, les AA les plus fréquents sont (de haut en bas) à titre indicatif. 3.4) Les protéines partagent des motifs communs

Gène ancestral dupliqué : le deuxième exemplaire a évolué pour que la protéine codée ait une fonction différente. On retrouve de même motif (par exemple EGF) dans des protéines très différentes. Chymotrypsine : fonction de clivage Facteur IX de la coagulation : fonction enzymatique importante pour la coagulation : 2 motif EGF (ça ne veut pas dire que la séquence primaire est exactement la même, mais une probabilité de trouver les mêmes AA)

3.5) Détermination de la structure tertiaire par cristallographie : Formation du cristal : Protéine à concentration élevée :

Détermination de la structure : diffraction

Le rayonnement X rencontre des atomes au sein de la protéine : déplacement du rayon incident. On a un capteur qui permet le calcul de l'angle de réfraction.

On ne peut pas toujours cristalliser les protéines ! 3.6) Autres méthodes de détermination des structures :

3.7) Formation des structures tridimensionnelles : Il existe un grand nombre de structures possibles : Structure primaire Ordre de la synthèse Environnement hydrophobe/hydrophile Interactions protéiques

3.7.1) Les protéines chaperones :

En rose : ribosome En bleu : chaine protéique en cours d'élongation L'acquisition d'une structure dans l'espace nécessite de l'énergie 3.7.2) Source d'énergie du changement de conformation :

TRIC nécessite l'hydrole d'au moins 2 molécules d'ATP

4) Purification des protéines 4.1) Séparation a) Broyage des tissus ou fractionnement cellulaire

On broit, puis on extrait et on re-liquifie. b) Précipitation différentielle :

Une fois la protéine liée au sel, elle devient insoluble. Les sels ont des pouvoirs précipitants variables : NH4+ > K+ > Na+

Exemple : Sulfate d'ammonium (NH4)2SO4 à 4M puis en faisant varier le % de sel

1)

Proche de leur pHi les protéines précipitent plus facilement c) Chromatographies : uniques ou séquentielles

importante car elles sont plus sépcifiques 4.2) Vérification de la pureté a) Activité enzymatique

A chaque étape on peut voir si l'activité enzymatique est toujours présente b) Electrophorèse

Si on connait les propriétés physico-chimiques c) Dosages immunologiques

Dans le cas d'un anticorps d) Tableaux de purification :

Activité spécifique = Activité totale / Masse A chaque étape, même si on augmente la concentration de la protéine, on en perd un peu : le rendement ne peut donc que diminuer. A la fin on a un rendement assez faible mais une purification de qualité (= augmentation de l'activité spécifique)

Le gel est déposé sur la surface imprégnée d'un liquide qui permet les échanges d'électrons. Un générateur crée une différence de potentiel On peut ainsi identifier les protéines;

4.3) Détection immunologique par Western blot : 1. Migration 2. Transfert : application sur le gel d'un polymère, protéine (qui était sur le gel) transférée sur la membrane 3. Hybridation : en présence d'un anticorps qui reconnait spécifiquement la protéine. Ensuite on lave la membrane (= on enlève tous les anticorps qui ne sont pas fixés à la protéine) 4. Révélation : identification des bandes formées par les anticorps (interaction anticorps-protéine + présence de l'activité enzymatique de la protéine)

4.4) Purification après électrophorèse bidimensionnelle : Combinaison de SDS avec le point isoélectrique Les protéines sont séparées selon leur point isoélectrique (arrêt de la migration), ensuite on met ce tube qui contient les protéines dans une électrophorèse SDS : Migration selon la masse. Ensuite on découpe la membrane pour récupérer la protéine et la remettre en solution (ou l'identifier avec la spectrométrie de masse)

4.5) Séparation par centrifugation : Principe : mobilisation des particules :

- Force gravitationnelle : artificielle F = 1,119 . 10-5 (rpm)2 R en g rpm = nombre de tours par minute (100.000 ou 200.000 tours/minutes) !! R = rayon en mm - Masse de la particule - Densité de la particule/milieu - Friction entre le milieu où se déroule la centrifugation et la protéine. Unité : le Svedberg S Dépend de la densité des particules Unité non additive : 2S + 3S = ???? 4.5.1) Centrifugation en gradient de densité :

Densité supérieure à celle du milieu : Sédimentation Densité inférieur au milieu : Stase : ne bouge pas Densité identique à celle d'un niveau : Arrêt de la mobilisation

5) Séquençage d'une protéine :

6) Mesure de la concentration protéique : Unité de masse le Dalton : 1 Da = 1,667 . 10-24 gr D'où la masse molaire : 1,667 . 10-24 x 6,022 . 1023 = 1 gr/mole 1. Absorption à 280 nm : tryptophane essentiellement. Attention aux contaminants, méthode peu précise [Prot] (mg/ml) = 1,55 A280 - 0,76 A260 2. Biuret : NH2-CO-NH-CO-NH2 en présence de CuSO4 (sulfate de cuivre) Les deux molécules se complexent à des groupements de type CO-NH ou CH-NH, le complexe formé absorbe dans le bleu : pic d'absorption à 545 nm. Méthode peu sensible : 2 à 6 g/L 3. Méthode de Lowry : Réactif : phosphotungstène molybdique en présence de CuSO4 Liaison aux tyrosines et aux tryptophanes Méthode sensible : 5-10 mg/L : bien meilleure sensibilité. Beaucoup d'interférences 4. Bradford : Bleu de Coomassie G250, le réactif est absorbé sur les protéines en milieu acide Pic d'absorption : 595 nm Méthode sensible : 2-5mg/L L'albumine absorbe que les autres protéines

7) Modifications post-traductionnelles : pas codées génétiquement mais peuvent être faite au cours de la traduction : les processus biologiques sont continus Fixation de lipides : Myristilation : Glycine en position 2 Farnésylation ou palmitoylation : cystéines Glycosylation : Formation d'une amide avec l'asparagine : N glyco

Formation d'une liaison osidique avec la sérine ou la théronine O glyco

Phosphorylation : ce sont les plus importantes fonctionnellement. Tyrosine, sérine ou thréonine

7.1) Exemple de phosphorylation :

Résumé :

8) Maturation des protéines : Traduction d'un ARN Prépro.... : peptide signal (de sécrétion), translocation dans le réticulum endoplasmique Pro... : avant maturation, clivage protéique, par des furines

L'insuline exogène ne comporte pas ce bout de peptides coupés.

9) Liaison protéine et ligand :

Le degré de liaison est alors :

Si [X] est faible, alors X(barre) --> 0 Peu de protéines => Peu de liaisons Si [X] est très grand, alors X(barre) --> 1

Equation de Scatchard :

On utilise également le Kd = 1/Ka Energie de la liaison du ligand : ΔG = - RT log Ka

Les immunoglobulines

Electrophorèse des protéines sériques Se fait sur gel d'agarose. Ces techniques vont être remplacées par des techniques d'électrophorèse capillaire La plus migratrice est l'Albuline, ensuite l'alpha 1, l'alpha 2 puis bêta 1, bêta 2 et gamma...

1) Généralités : Protéines sériques excrétées par les lymphocytes B Chaque molécule reconnait un antigène spécifique 1 cellule = 1 antigène Il existe 5 classes ou isotypes d'immunoglobulines IgA (salive/larmes), IgG (1-4), IgM (dans le sérum du plasma), IgD (très peu représenté) et IgE (impliquées dans les phénomènes allergiques) La détermination de la structure a été possible grâce aux myélomes

Myélomes :

2) Electrophorèse des protéines sériques

3) Structure des Immunoglobulines :

Les immunoglobulines ont une structure quaternaire, ce sont des hétéroprotéines, elles sont composées de 2 types de chaines : chaines lourdes (en violet) et chaines légères (en lourdes). Les chaines lourdes sont associées entre elle par un ou plusieurs pont disulfure. Les chaines légères sont également associées aux chaines loureds par un ou plusieurs ponts disulfures, en revanche les chaines légères entre elles ne sont pas associées. Les Ig A et les Ig M sont impliquées dans la formation de structure encore plus complexe. Ig A : associées en dimères Ig M structure pentamérique Les chaines lourdes sont composées de domaines constants (1 à 4 selon les types d'Ig), ces domaines sont reliés entre eux par des régions charnières qui comportent les ponts disulfures. On retrouve dans les chaines lourdes et dans les chaines légères des régions spécifiques : régions variables : ce sont elles qui font la différence entre 2 Ig : composition en AA variable. 3.1) Clivage d'une Ig par la papaïne :

identification de 2 types de structure : - Fab - Fc : fragment constant Avec la papaïne, le clivage se fait en amino-terminal du ou des ponts disulfures qui unissent les chaines lourdes d'Ig : si on a 1 mole d'Ig on va générer 3 moles de protéines (2 Fab + 1 Fc)

4) Polymorphisme des Ig :

IgG chimériue, les acides aminés en jaune, violet et orange sont différents entre deux types d'IgG.

5) Structure quaternaire des Immunoglobulines :

6) Les domaines variables :

Une série de domaine variable par chaine lourde Une série par chaine légère Les CDR sont des boucles reliant des brins (bêta) Les CDR "constituent" le site de liaison à l'antigène

On a pas le même domaines variables d'une chaine lourdes à une chaine légère; en revanche, un Ig produite par une cellule a les deux meme domaines variables sur ces 2 chaines lourdes.

Unité des domaines constants : 2 feuillets (bêta) constitués de 4 et 3 brins

Région variable : Association de 2 feuillets (beta) formés de 4 et 5 brins Il y a dans le sous domaine Ig : il y a la fois des feuillet beta et des hélices (alpha) Les régions en rouges correspondent aux boucles (CDR 1, CDR 2 et CDR 3)

7) Les différentes formes d'immunoglobulines :

La région J permet la sécrétion de cette protéine et la structuration en forme pentamérique (pour les IgM et les IgA)

8) Différentes fonctions des immunoglobulines :

9) Les différents types de récepteurs aux Ig :

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