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VECTORES TOPO TA Técnica que permiten clonar nuestro vector de interés en un vector de una manera diferente que no sea a través de enzimas de restricción y de forma sencilla. Básicamente este sistema se basa en el hecho de que la Taq-ADNpolimerasa no corrige los errores, la modificación de esta, sin embargo, añade en los extremos 3’ una Adenosina. Entonces, el producto de la PCR (de la segunda Taq-ADNpolimerasa) podrá ser clonado directamente dentro de un vector. Hay diferentes maneras de obtener este vector compatible con este producto de PCR. Una de ellas es utilizar un vector comercial de in-vitro-gen que tiene ya una T en el extremo 3’ de este vector y otra T en el otro extremo 3’ del mismo vector linealizado, tiene unida la topoisomerasa en un extremo y la otra en el otro extremo. Entonces al mezclar el vector linealizado comprado in vitro gen y añadimos nuestro producto de PCR, lo que pasará es que los extremos son compatibles. Además las topoisomerasas son enzimas que tienen la capacidad para cortar y unir ADN. En este caso el ADN ya está cortado por lo que lo único que hará la topoisomerasa es ligar (unir) los extremos correspondientes, como consecuencia de este proceso la topoisomerasa se liberará y nos quedará el fragmento de ADN recombinante donde tenemos el vector y el inserto. El sistema es sencillo y rápido (5 min para que la topoisomerasa actúe). A partir de aquí sólo nos queda transformar las células. INCONVENIENTES: no se puede dirigir el inserto, se puede colocar del derecho y del revés. Pero este es un problema menor en según qué casos. Si por ejemplo nosotros lo que queremos es secuenciar o propagar el gen y no expresarlo, en este caso no será importante que esté posicionado de forma direccional. [vídeos de power para saber cómo conseguir vectores linealizados con timinas protuverantes- sistema TA]...