Versuch 1 Übungsfragen PDF

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Wintersemester Praktikum...

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V1 Übungsfragen 1. Was sind die 4 wichtigen Komponenten eines bakteriellen Plasmidvektors und wozu dienen diese jeweils? Welche dieser Komponenten sind essentiell? 2. Wieso lässt man die transformationskompetenten Zellen auf Eis auftauen und nicht bei Raumtemperatur? Nach Zugabe der Plasmide lässt man den Transformationsansatz noch 10 Minuten auf Eis inkubieren. Wozu dient diese Inkubation? 3. Warum werden die Transformationsansätze nach der eigentlichen Transformation und vor dem Ausplattieren noch für 20-40 min bei 37°C inkubiert? 4. Warum führen wir bei dem Versuch zur Bestimmung der Transformationseffizienz einen Kontrollansatz ohne Plasmidzugabe durch? Was könnte der Grund dafür sein, falls wir bei diesem Ansatz einige wenige Kolonien finden? Was könnte passiert sein, wenn wir sehr viele Kolonien oder einen Bakterienrasen finden? 5. Wie ist die Transformationseffizienz definiert? 6. Wieso sind die Kolonien bei dem Versuch zur Bestimmung der Transformationseffizienz blau? 7. Gelegentlich treten bei dem Versuch zur Bestimmung der Transformationseffizienz auch weiße Kolonien auf. Wie können Sie diese erklären? 8. Was ist der Sinn des Kontroll-Ligationsansatzes (Ansatz 2)? Bei diesem Ansatz treten in einigen Fällen Kolonien auf. Woran könnte das liegen (2 Möglichkeiten)? Welches weitere Kontrollexperiment könnten Sie durchführen, um zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden? 9. Vor der Ligation wurde der Vektor pUC19 mit BamHI geschnitten und mit Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Beide Enzyme wurden danach inaktiviert. Warum wurde das gemacht? Wie kann man Enzyme inaktivieren? 10. Warum mischen Sie die Ligationsansätze durch vorsichtiges Rühren und nicht durch Vortexen? 11. Aus welchen drei Komponenten besteht der Ligasepuffer und wozu dienen diese? 12. In welchem molaren Verhältnis zueinander werden bei einer Ligationsreaktion Vektor und Insert eingesetzt? 13. Welches sind neben der Substrat- und der Enzymkonzentration die wichtigsten drei Optima für eine enzymatische Reaktion? 14. Was ist der Sinn der Blau/Weiß-Färbung? Wozu dienen jeweils die drei Komponenten in den LB-AIX-Selektionsplatten (Ampicillin, IPTG, X-Gal)? 15. Was sind Satellitenkolonien und wie erklären Sie ihr Auftreten? 16. Warum haben wir überhaupt eine Genbank von E. coli hergestellt? Was kann man mit einer solchen Genbank machen? 17. Wie kann man sicherstellen, dass in dieser Genbank möglichst alle Bereiche des Genoms von E. coli enthalten sind? 18. Es gibt Bereiche des Genoms von E. coli, die wahrscheinlich in der Genbank nicht enthalten sind, weil bei der Klonierung dieser Bereiche in E. coli Probleme auftreten. Um welche Bereiche des Genoms von E. coli könnte es sich dabei handeln, warum treten bei der Klonierung dieser Bereiche in E. coli Probleme auf, und wie könnte man diese Bereiche trotzdem klonieren? 19. Welchen Vorteil hat die Isolation eines genomischen Bereichs aus einer Genbank gegenüber der Amplifikation dieses Bereichs direkt aus dem Genom mittels PCR?...