Versuch von Meselson und Stahl zur DNA Replikation PDF

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Summary

Kurze Zusammenfassung der wesentlichen Punkte um einen Überblick über den zu lernenden Stoff zu vermitteln und um diesen dann auf Übungsaufgabe Anwesen zu können....

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Semikonservative DNA-Replikation Experiment von Meselson und Stahl 1958

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Was beweist das Meselson-Stahl Experiment? In jeder Zelle deines Körpers befindet sich dein komplettes Erbgut in Form der DNA. Jeden Tag teilen sich Milliarden von Zellen. Doch wie wird die DNA eigentlich verdoppelt (repliziert)? Genau mit dieser Frage haben sich Matthew Meselson und Franklin Stahl befasst. Zuerst haben sie drei Hypothesen aufgestellt wie die Replikation (Verdopplung) der DNA-Doppelhelix ablaufen könnte: Hypothese - Konservative Replikation: Die Hypothese der konservativen Replikation besagt, dass von der DNA ein identisches Abbild angefertigt wird – so, als legte man die DNA auf einen Kopierer. Also bleibt die Ausgangs-DNA bestehen und es wird ein komplett neues DNA-Molekül synthetisiert (hergestellt). Hypothese- Semikonservative Replikation: Bei der semikonservativen Replikation ging man davon aus, dass sich die DNA in ihre beiden Einzelstränge aufteilt und anschließend der jeweils fehlende (komplementäre) Strang nachgebildet wird. Hypothese - Disperse Replikation: Bei der letzten Hypothese, der dispersen Replikation, nahm man an, dass sich die Ausgangs-DNA in ihre einzelnen Nucleotide (Base + Pentose + Phosphatgruppe) aufteilt und die fehlenden Nucleotide nachgebildet werden, so dass am Ende zwei DNA-Moleküle entstehen.

Abb. 1: Übersicht über die drei theoretisch möglichen Replikationsmechanismen der DNA (Quelle:Wikipedia) Exkurs: Was sind Isotope? Ein Isotop bezeichnet ein Atom mit gleich vielen Protonen, aber unterschiedlich vielen Neutronen. Dies führt dazu, dass unterschiedliche Isotope, eine unterschiedliche Masse (Gewicht) haben. Die Zahl links oben bezeichnet die gesamte Zahl von Protonen und Neutronen zusammen. 2

Das Experiment Um eine ihrer Hypothesen zu belegen, überlegten sich Meselson und Stahl eine Methode, wie sie die Ausgangs-DNA markieren könnten. Da Stickstoff (N) nicht in die Proteine, sondern nur in die DNA eingebaut wird, entschieden sie sich die Ausgangs-DNA mit dem schwereren Stickstoffisotop 15N (anstelle des regulären, leichteren 14 N) zu markieren. Dies führt dazu, dass die Ausgangs-DNA schwerer ist als normal. Um diesen kleinen Dichteunterschied sichtbar zu machen, nutzten sie die Cäsium-ChloridGleichgewichtszentrifugation (oder-Dichtegradienten-Zentrifugation). Dabei wird eine CäsiumChlorid-Lösung (CsCl-Lösung) in einer Ultrazentrifuge (Zentrifuge: ein Gerät, welches durch starke Rotation künstliche Schwerkraft erzeugt) 60 Stunden zentrifugiert. Durch diese hohe künstliche Gravitation (Schwerkraft) bildet sich ein Dichtegradient aus. Das heißt, dass die Dichte am Boden des Reagenzglases höher ist und nach oben hin niedriger wird. Wenn nun Moleküle dazugegeben und nochmals zentrifugiert werden, sinken sie an die Stelle, welche ihrer eigenen Dichte entspricht. Es bilden sich Banden, welche durch bestimmte Strahlung sichtbar gemacht werden können. Für ihr Experiment ließen sie eine Zellkultur E.coli Bakterien auf einem Nährboden wachsen, welcher ausschließlich das schwere Strickstoffisotop 15 N enthielt. Anschließend entnahmen sie einige Zellen, gaben sie in die CsCl-Lösung und zentrifugierten diese erneut. Es bildete sich, wie erwartet, eine Bande im unteren, dichteren Bereich der CsCl-Lösung, da in die isolierte DNA ausschließlich der schwere Stickstoff eingebaut war. Im nächsten Schritt wurde die Bakterienkultur auf ein Nährmedium übertragen, welches ausschließlich das leichte Stickstoffisotop 14N enthielt. Man wartete bis sich die Bakterien einmal geteilt hatten und entnahm eine weitere Probe. Diese zweite Probe wurde auch in eine CsCl-Lösung gegeben und zentrifugiert. Es bildete sich eine Bande im mittleren Bereich der Lösung. Nun Bestand jedes DNA-Molekül zur Hälfte aus schwerem und zur Hälfte aus leichtem Stickstoff. Im letzten, bedeutsamsten Schritt des Experiments wartete man bis sich die Bakterien ein weiteres Mal geteilt hatten. Danach entnahm man eine dritte Probe der Bakterien, welche man auch mit der CsCl-Lösung zentrifugierte. Es bildeten sich zwei Banden, eine im mittleren Bereich der Lösung und eine im oberen, weniger dichten Bereich der Lösung. Der letzte Schritt des Experiments bewies, dass sich die DNA semikonservativ repliziert. Nun bestanden fünfzig Prozent der DNA-Moleküle zur Hälfte aus schwerem und zur Hälfte aus leichtem Stickstoff, das heißt sie hatten einen „schweren“ und einen „leichten“ Strang und bildeten daher die mittlere Bande. Die anderen fünfzig Prozent bestanden komplett aus leichtem Stickstoff. Würde die DNA anderes repliziert werden, dann hätte das Bandenmuster anders ausgesehen.

Und warum wurde Escherichia coli verwendet? Dieses Bakterium ist im menschlichen und tierischen Darm zu finden. Es wird von Wissenschaftlern besonders gerne als Forschungsorganismus benutzt, da es sehr pflegeleicht ist und sich ca. alle 20 Minuten teilt, somit können Experimente schneller durchgeführt werden als mit anderen Bakterienstämmen.

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Abb. 2: Meselson und Stahl Versuchsschema - Beweis für die semikonservative Replikation (Quelle: Wikipedia)

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