Ćw. 5. Oksydoreduktazy PDF

Preview

Summary

Instrukcja ćwiczeniowa...

Description

WETERYNARIA Ćwiczenie 5.

MITOCHONDRIA OZNACZANIE ENZYMÓW Z KLASY OKSYDOREDUKTAZ

Część praktyczna obejmuje: - wykrywanie aktywności oksydoreduktaz (katalazy, peroksydazy, oksydazy cytochromowej) w homogenacie z wątroby i ekstrakcie z ziemniaka

WSTĘP Oksydoreduktazy Oksydoreduktazy katalizują przeniesienie równoważników redukcyjnych między dwoma układami redoks. Termin równoważnik redukcyjny określa kombinację elektronów i protonów, które pojawiają się w procesach redoks (Ryc. 1.).

Ryc. 1. Równoważniki redukcyjne w biologicznych układach redoks Procesy oksydacyjno-redukcyjne w komórkach zachodzą we wszystkich przedziałach subkomórkowych (cytozolu, wewnętrznej błonie mitochondriów, w błonie tylakoidów, błonach siateczki śródplazmatycznej, błonie jądrowej, a także w przestrzeni międzykomórkowej). Procesy te są katalizowane przez enzymy współdziałające z rozpuszczalnymi (koenzymy) lub związanymi z białkiem enzymatycznym (grupy prostetyczne) kofaktorami. Najważniejszymi kofaktorami oksydoreduktaz są: NAD+, NADP+, FMN, FAD, ubichinon (koenzym Q), plastochinon, plastocyjanina, lipoamid, hem oraz kilka rodzajów centrów żelazowo-siarkowych. Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD+) oraz jego forma ufosforylowana – fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADP+), koenzymy przenoszące jony wodorkowe (2e- i 1H +), wykorzystywane są przez ponad 200 oksydoreduktaz. 1

Powstawanie w komórce nadtlenku wodoru (H2O2) W komórce nadtlenek wodoru powstaje w wielu różnych reakcjach. Jednym z jego źródeł jest reakcja katalizowana przez dysmutazę ponadtlenkową – enzym usuwający anionorodniki ponadtlenkowe zgodnie z reakcją: O2•− + O2•− + 2H+ → H2O2 + O2 Anionorodnik ponadtlenkowy (O2•−) jest produktem ubocznym wielu reakcji redoks powstającym w wyniku częściowej redukcji tlenu cząsteczkowego (przyjęcie jednego elektronu). Anionorodniki ponadtlenkowe powstają np. jako produkty uboczne fazy jasnej fotosyntezy, czy w reakcji katalizowanej przez oksydazę NADPH+H+ zlokalizowaną w błonie komórkowej. Ważnymi enzymami wytwarzającymi H2O2 są także różne oksydazy, np. oksydazy flawoproteinowe (utlenianie aminokwasów), oksydazę acylo-CoA (szlak -oksydacji kwasów tłuszczowych). Nadtlenek

wodoru

jest

związkiem

szkodliwym,

głównie

ze

względu

na

możliwość powstawania w obecności Fe2+ rodników hydroksylowych .OH, a także tlenu singletowego 1O2.

Enzymatyczne usuwanie H2O2 Enzymami funkcjonującymi w usuwaniu H2O2 są: katalaza i peroksydaza. Katalaza, enzym zawierający hem, dysproporcjonuje dwie cząsteczki H2O2 do H2O i O2 zgodnie z równaniem: 2 H2O2 → 2H2O + O2 Katalazy mogą także wykazywać aktywność peroksydacyjną, w której H 2O2 jest wykorzystywany do utleniania alkoholi, aldehydów, fenoli czy azotynów.

Peroksydazy redukują nadtlenek wodoru równocześnie utleniając (odwodorowując) różne substraty. Reakcję katalizowaną przez peroksydazy można zapisać: SH2 + H2O2 → S + 2H2O

2

(SH2 i S to odpowiednio, substrat w stanie zredukowanym i utlenionym). Grupą prostetyczną peroksydaz roślinnych jest żelazoprotoporfiryna (hemina), natomiast enzymy zwierzęce zawierają inny typ heminy. Ważną funkcję ochronną w komórkach zwierząt i roślin spełnia peroksydaza glutationowa współdziałająca z glutationem w usuwaniu nadtlenku wodoru i szkodliwych nadtlenków organicznych. W centrum aktywnym tego enzymu występuje analog cysteiny (selenocysteina), w którym siarka została zastąpiona selenem.

Mitochondria Mitochondria są owalnymi lub kulistymi organellami o wymiarach 2-8 µm. Otoczone są dwiema błonami. Błona zewnętrzna mitochondrium jest łatwo przepuszczalna dla małych cząsteczek (jonów, metabolitów), gdyż zawiera poryny – białka tworzące pory w formie otwartej beczułki. Błona wewnętrzna, tworząca szereg skierowanych do matriks grzebieni, jest nieprzepuszczalna dla wszystkich jonów i cząsteczek polarnych. Zatem w mitochondriach istnieją dwa przedziały: przestrzeń międzybłonowa i matriks. W matriks zachodzą reakcje utleniania i karboksylacji kwasu pirogronowego, reakcje cyklu Krebsa, a także reakcje utleniania kwasów tłuszczowych. W błonie wewnętrznej są zlokalizowane: łańcuch transportu elektronów (łańcuch oddechowy), fosforylacja oksydacyjna (synteza ATP) i liczne białka pośredniczące w transporcie metabolitów i jonów.

Ryc. 2. Schemat budowy mitochondrium (Stryer 2005). Metabolizm pirogronianu Powstający w glikolizie pirogronian, w warunkach tlenowych zostaje przetransportowany przez odpowiedni nośnik do matriks, gdzie ulega dekarboksylacji oksydacyjnej do acetyloCoA zgodnie z reakcją:

3

Reakcja jest katalizowana przez duży kompleks dehydrogenazy pirogronianowej, obejmującej właściwie trzy enzymy (patrz podręcznik, kurs podstawowy). Tworzący się w tej nieodwracalnej reakcji acetylo-CoA jest metabolizowany dalej w cyklu Krebsa, natomiast NADH+H+ jest utleniany w łańcuchu oddechowym. W warunkach niedoboru glukozy, w organizmie rozpoczyna się jej synteza w szlaku glukoneogenezy. W tych warunkach, wewnątrz matriks pirogronian ulega karboksylacji do szczawiooctanu zgodnie z reakcją:

Reakcja jest katalizowana przez karboksylazę pirogronianu, której koenzymem jest biotyna. Wytworzony w matriks szczawiooctan jest redukowany przez dehydrogenazę jabłczanową do jabłczanu, który jest transportowany przez odpowiedni nośnik do przestrzeni międzybłonowej, a dalej do cytoplazmy. W cytoplazmie jabłczan ulega utlenieniu do szczawiooctanu, który jest teraz przekształcony do fosfoenolopirogronianu zgodnie z reakcją:

Powstający fosfoenolopirogronian wchodzi w szlak przemian prowadzący do biosyntezy glukozy. Szlak glukoneogenezy, rozpoczynający się od fosfoenolopirogronianu, jest odwróceniem szlaku glikolizy, za wyjątkiem dwóch reakcji 3 i 1 (patrz podręcznik, kurs podstawowy).

4

Cykl kwasu cytrynowego (cykl Krebsa) Acetylo-CoA, powstający z pirogronianu, (a także m.in z utleniania kwasów tłuszczowych), zostaje włączony w przemiany cyklu kwasu cytrynowego nazywanego również cyklem Krebsa (Ryc. 3.). Obejmuje on 8 zachodzących kolejno reakcji, w których grupa acetylowa CH3-CO- zostaje utleniona do 2 cząsteczek dwutlenku węgla, a powstające równoważniki redukcyjne przenoszone są na NAD+ i na FAD. W efekcie powstają 3 cząsteczki

NADH+H+

i

jedna

cząsteczka

FADH2

(związana

z

dehydrogenazą

bursztynianową). Siedem enzymów cyklu Krebsa występuje na terenie matriks, a tylko dehydrogenaza bursztynianowa jest zlokalizowana w wewnętrznej błonie mitochondrium (kompleks II na Ryc. 4.).

Ryc. 3. Cykl kwasu cytrynowego (Stryer 2005, zmieniono).

5

Łańcuch transportu elektronów (łańcuch oddechowy) Łańcuch oddechowy transportuje elektrony z NADH+H+ (2 elektrony) lub zredukowanego ubichinonu na końcowy akceptor, którym jest tlen cząsteczkowy. Łańcuch obejmuje 3 białkowe kompleksy (kompleks I, III i IV) oraz dwie ruchome cząsteczki przenośnikowe: ubichinon (Q) i cytochrom c (Ryc. 4.). Poza tym, z błoną wewnętrzną jest związana dehydrogenaza bursztynianowa (kompleks II), a także 4 inne dehydrogenazy, które również przekazują elektrony na ubichinon (Q) (nie pokazano na Ryc. 4.). Tak więc, ubichinon może być redukowany enzymatycznie w reakcjach utleniania NADH+H+ i bursztynianu, a także w trakcie utleniania: acylo-CoA, glicerolo-3-fosforanu, choliny i dihydroorotanu (wszystkie cztery dehydrogenazy są zlokalizowane w błonie wewnętrznej, podobnie jak dehydrogenaza bursztynianowa). Większa część energii towarzysząca reakcjom redoks jest wykorzystywana do tworzenia w poprzek błony wewnętrznej gradientu protonowego (wypompowanie H+ z matriks), który z kolei „napędza” syntezę ATP katalizowaną przez syntazę ATP (kompleks V na Ryc. 4.).

Oksydaza cytochromowa (EC 1.9.3.1) Ostatnim ogniwem łańcucha oddechowego jest kompleks oksydazy cytochromowej (kompleks IV), który przejmuje elektrony z cytochromu c, małego białka zawierającego żelazo w układzie hemowym. Do redukcji 1 cząsteczki tlenu (O2) do dwóch cząsteczek wody potrzebne są 4 elektrony (4 cząsteczki zredukowanego cytochromu c). Przeniesieniu dwóch elektronów przez związane z enzymem kofaktory (dwa jony miedzi (CuA i CuB), jony żelaza w dwóch układach hemowych – hem a i hem a3) towarzyszy wypompowanie z matriks do przestrzeni międzybłonowej 4 H+.

6

4H+

2H+

4H+

2H+

Ryc. 4. Transport elektronów w łańcuchu oddechowym utworzonym przez trzy kompleksy białkowe i dwa małe ruchome nośniki (ubichinon i cytochrom c). Dwa elektrony pochodzące z utlenianego NADH+H+ są transportowane przez szereg układów oksydacyjno-redukcyjnych i ostatecznie docierają do tlenu. Kompleks II (widoczny od wewnątrz i od zewnątrz błony) pokazuje lokalizację dehydrogenaz utleniających: bursztynian, acylo-CoA, glicerolo-3fosforan, cholinę, dihydroorotan. We wszystkich tych reakcjach 2 elektrony i 2 protony są przenoszone na FAD, a dalej na ubichinon (Q). Transportowi elektronów wzdłuż łańcucha oddechowego towarzyszy wektorowe pompowanie protonów z matriks do przestrzeni międzybłonowej prowadzone przez kompleksy I, III i IV. Dehydrogenazy kompleksu II nie są pompami protonowymi. Tworzący się na błonie wewnętrznej gradient H + stanowi siłę napędową do syntezy ATP przez kompleks syntazy ATP (kompleks V) (Koolmam, Röhm 2005).

7

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA A. Przygotowanie homogenatu z wątroby Odczynniki: - bufor do homogenizacji tkanki: 50 mM bufor fosforanowy, pH 7,4 Wykonanie (przygotować dwa preparaty na całą grupę): 2 g wątroby drobno pociąć i umieścić w pojemniku do homogenizacji. Dodać 18 ml 50 mM buforu fosforanowego, pH 7,4. Pojemnik umieścić w lodzie i homogenizować w homogenizatorze nożykowym 3 razy po 30 sek. z 30 sekundowymi przerwami. Uzyskany homogenat przesączyć przez 4 warstwy gazy, po czym wirować 10 minut przy 3000 obr/min.. Supernatant delikatnie zdekantować do czystej próbówki i pozostawić w lodzie. Przygotowany homogenat z wątroby rozcieńczyć 5 razy.

B. Przygotowanie ekstraktu z ziemniaka Wykonanie: Umyty i obrany ziemniak utrzeć na tarce. Miazgę włożyć do woreczka z gazy i zanurzyć w zlewce zawierającej około 200 ml wody, a następnie lekko wycisnąć zawartość. Roztwór łagodnie wymieszać. Po opadnięciu skrobi na dno zlewki, płyn ostrożnie zlać znad osadu. Uzyskujemy w ten sposób wodny ekstrakt enzymu. Część nadsączu (około 50 ml) przelać do zlewki i zagotować, a następnie zdenaturowany termicznie ekstrakt ostudzić wkładając zlewkę do zimnej wody.

C. Wykrywanie aktywności katalazy Tlen uwolniony w reakcji dysproporcjonowania H 2O2 katalizowanej przez katalazę wydzielając się z roztworu powoduje jego silne pienienie.

2 H 2O 2 → 2 H 2O + O 2 Odczynniki: - 3% roztwór H2O2, - roztwór KCN (UWAGA! KCN jest silną trucizną!)

8

Wykonanie: Do probówek odmierzyć podane w tabeli objętości odczynników i odpowiedniego preparatu enzymatycznego. Obserwować zachodzące zmiany i zanotować wyniki.

Tabela 1. Wykrywanie katalazy w ekstrakcie z ziemniaka. Nr próby

Ekstrakt z ziemniaka

KCN

H2O2

1

2 ml

0

5 kropli

2*

2 ml

0

5 kropli

3

2 ml

2 krople

5 kropli

2* - zagotowany ekstrakt z ziemniaka Tabela 2. Wykrywanie katalazy w homogenacie z wątroby. Nr próby

Rozcieńczony homogenat z wątroby

1

1 ml

H2O2 5 kropli

Opracowanie wyników: Opisać wyniki reakcji i podać wnioski.

D. wykrywanie aktywności peroksydazy Benzydyna w

obecności H2O2 ulega utlenieniu

benzydynowego.

9

przez peroksydazę do błękitu

Odczynniki: - 3% roztwór H2O2, - roztwór KCN (UWAGA! KCN jest silną trucizną!) - roztwór benzydyny w kwasie octowym

Wykonanie: Do probówek odmierzyć podane w tabelach objętości odczynników i odpowiedniego preparatu enzymatycznego. Zawartość probówek wymieszać i zostawić na 20 min. w temperaturze pokojowej. Obserwować zachodzące zmiany i zanotować wyniki.

Tabela 3. Wykrywanie peroksydazy w ekstrakcie z ziemniaka. Nr próby

Ekstrakt z ziemniaka

Woda

KCN

Analog benzydyny

H2O2

1

2,5 ml

-

-

0,1 ml

0,1 ml

2

2,5 ml

0,1 ml

-

-

0,1 ml

3

2,5 ml

-

2 krople

0,1 ml

0,1 ml

4*

2,5 ml

-

-

0,1 ml

0,1 ml

5

2,5 ml

0,1 ml

-

0,1 ml

-

Woda

Analog benzydyny

H2O2

4* - zagotowany ekstrakt z ziemniaka

Tabela 4. Wykrywanie peroksydazy w homogenacie z wątroby. Nr próby

Rozcieńczony homogenat z wątroby

1

1 ml

-

0,1 ml

0,1 ml

2

1 ml

0,1 ml

-

0,1 ml

Opracowanie wyników: Opisać wyniki reakcji i podać wnioski.

10

E. Wykrywanie aktywności oksydazy cytochromowej Obecność oksydazy cytochromowej można wykazać w reakcji, w której wykorzystywany jest odczynnik NADI. W skład odczynnika wchodzą: -naftol i p-fenylenodwuamina zmieszane w stosunku 1:1. W wyniku nieenzymatycznej redukcji zawartego w mitochondriach cytochromu c przez p-fenylenodwuaminę powstaje p-fenylenodwuimina, która w obecności -naftolu przechodzi w barwny, niebieski kompleks zgodnie z reakcją:

Odczynniki: - 50 mM bufor Tris-HCl, pH 7,6 -

odczynnik

NADI

(przygotować

bezpośrednio

przed

użyciem,

mieszając

p-fenylenodwuaminę z -naftolem w stosunku 1 : 1) - 5% roztwór KCN (UWAGA! KCN jest silną trucizną!)

Wykonanie: Przygotować dla całej grupy 2 ml odczynnika NADI, poprzez zmieszanie -naftolu i pfenylenodwuaminy w stosunku 1:1. Do probówek odmierzyć podane w tabelach objętości odczynników i odpowiedniego preparatu enzymatycznego. Próby starannie wymieszać i pozostawić na 30 min w temperaturze pokojowej. Obserwować powstanie niebieskiej barwy.

Tabela 5. Wykrywanie oksydazy cytochromowej w ekstrakcie z ziemniaka. Nr próby

Ekstrakt z ziemniaka

Woda

Bufor pH 7,4

KCN

NADI

1

1 ml

-

1 ml

-

0,1 ml

2

1 ml

-

1 ml

1 kropla

0,1 ml

3

1 ml

0,1 ml

1 ml

-

-

4*

1 ml

-

1 ml

-

0,1 ml

4* - zagotowany ekstrakt z ziemniaka

11

Tabela 6. Wykrywanie oksydazy cytochromowej w homogenacie z wątroby. Nr próby

Rozcieńczony homogenat z wątroby

Woda

Bufor pH 7,4

NADI

1

1 ml

-

1 ml

0,1 ml

2

1 ml

0,1 ml

1 ml

-

Opracowanie wyników: Opisać wyniki reakcji i podać wnioski.

Zagadnienia do przygotowania: - budowa i funkcja mitochondriów - metabolizm pirogronianu w mitochondriach - cykl kwasu cytrynowego - lokalizacja błonowa poszczególnych ogniw łańcucha oddechowego - rola transportu elektronów w łańcuchu oddechowym - sprzężenie oddychania z fosforylacją oksydacyjną

Literatura: 1. Biochemia – J. M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, PWN, Warszawa, 2005 2. Cytobiochemia – L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa, 2002 3. Ćwiczenia z biochemii – pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa, 2005

12...