Zellbio Protokoll PDF

Preview

Summary

Zellbiologie Protokoll...

Description

Fachbereich 2 Biologie/Chemie

Protokoll zum Laborpraktikum Grundkurs Zellbiologie VAK 02-02-BIO2-2 Prof. Dr. Jörg Bormann Dr. Anette Peter WiSe 18/19 Mittwochsgruppe Tutorinnen: Sophie Baars, Denise Meyerhoff

1. Kurstag

Thema des ersten Kurstages war der Aufbau von Epithelgewebe sowie der Umgang mit dem Lichtmikroskop. Es wurden Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbte Querschnitte der Darmzotten von Rattus norvegicus betrachtet. Dabei wurden mithilfe des zuvor geeichten Okularmikrometers die

Kerndurchmesser von zehn Darmepithelzellen (Saumzellen) gemessen sowie daraus der Mittelwert errechnet.

Tabelle 1: Gesichtsfeld- und Maßstabstabelle Objektiv

Gesichtsfeld Ø [µm]

Abstand zwischen zwei Teilstrichendes Okularmikrometers entspricht [µm]

10x

1800

9,6

40x

420

2,4

100x

170

1

Gesichtsfeld Ø [µm]

Abstand zwischen zwei Teilstrichendes

(Gemessen von: Merle König) Objektiv

Okularmikrometers entspricht [µm] 10x

1800

10

40x

480

2,5

100x

19

1

(Gemessen von: Jana Paul)

Tabelle 2: Kerndurchmesser von Saumzellen (Längsmessung) Saumzelle

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Mittelwert

[µm]

7,2

7,2

8,4

7,2

9,6

10,8

7,2

9,6

7,2

9,6

8,4

(Gemessen von: Merle König) Saumzelle

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Mittelwert

[µm]

10

12,5

10

10

10

12,5

15

12,5

12,5

12,5

11,75

(Gemessen von: Jana Paul)

Aufgabe 4: Die Köhlersche Beleuchtung ist eine Einstellung des Mikroskops, die zum einen für eine gleichmäßige Ausleuchtung des Präparats sorgt, indem mithilfe des Kondensors die Leuchtfeldblende in der Ebene des Objekts abgebildet wird. Zum anderen wird die Entstehung von störendem Streulicht von Stellen außerhalb des Gesichtsfeldes vermieden, was mithilfe einer Begrenzung der beleuchteten Fläche durch die Leuchtfeldblende erreicht wird. Die Auflösungsgrenze eines Lichtmikroskops wird durch das Auflösungsvermögen bestimmt. Dieses ist der minimale Abstand bei dem zwei Punkte noch getrennt voneinander abgebildet werden können. Es ist von der Wellenlänge des benutzten Lichts, dem Öffnungswinkel des Objektivs und dem Brechungsindex des Mediums zwischen Objekt und Objektiv abhängig. 1

Die förderliche Vergrößerung hängt von der numerischen Apertur (wirksame Öffnungsweite oder Lichtstärke) eines Objektivs und der individuellen Sehschärfe, d.h. vom Auflösungsvermögen des Betrachters ab. Sie beträgt ungefähr das 500-1000-fache der numerischen Apertur des Objektivs.

2. Kurstag

Das Thema des zweiten Kurstages war die Spermatogenese und die Oogenese. Dazu wurden Schnittpräparate der Hodenkanäle von Rattus norvegicus und der Ovarien sowie der Oocyten junger Xenopus laevis untersucht. Des Weiteren wurden Messungen der Kerndurchmesser von zehn Sertolizellen, zehn Spermatogonien und zehn Spermatocyten 1. Ordnung durchgeführt und jeweils deren Mittelwert bestimmt.

Tabelle 3: Kerndurchmesser von Zellen des Hodenkanals von Rattus norvegicus (Längsmessung) [µm] 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Mittelwert

Sertolizelle

12

10

9

8

15

10

12

10

10

13

10,9

Spermatogonie

5

6

6

4

6

5

8

6

7

5

5,8

Spermatocyte I

7

10

11

9

8

10

9

9

8

11

9,2

(Gemessen von: Merle König) 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Mittelwert

Sertolizelle

8

10

11

13

17

14

15

14

12

12

12,6

Spermatogonie

6

7

7

6

8

8

6

7

6

7

6,8

Spermatocyte I

10

10

10

12

10

11

10

10

11

9

10,3

(Gemessen von: Jana Paul)

Diskussion:

2

Die abweichenden Messungen der beiden Teilnehmerinnen in Tabelle 2 und 3 sind entweder durch unterschiedliche Kerndurchmesser (z.B. unterschiedliche Perspektiven durch die Präparation oder unterschiedliche Kerngrößen) oder Messfehler (z.B. Quermessung statt Längsmessung) zu erklären.

3. Kurstag

Am dritten Kurstag ging es um Mitose und Meiose. Betrachtet wurden dafür Wurzelspitzen von Vicia faba, sowohl gefärbter Quetschpräparate als auch Schnittpräparate im Phasenkontrast, um die verschiedenen Mitosestadien zu identifizieren und deren relative Dauer zu bestimmen. Außerdem wurden erneut die Kerndurchmesser gemessen. Im Bezug auf die Meiose wurden Querschnitte der Blüten von Lilium mikroskopiert, in denen die Entwicklung von der Pollenmutterzelle zur Pollentetrade zu beobachten ist.

Tabelle 5: Kerndurchmesser von Zellen der Wurzelspitze (Vicia faba) Kern

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Mittelwert

[µm]

12

14,4

9,6

9,6

12

14,4

12

12

14,4

7,2

11,76

(Gemessen von: Merle König) Kern

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Mittelwert

[µm]

10

12,5

10

12,5

10

10

15

10

10

10

11

(Gemessen von: Jana Paul)

Tabelle: Relative Dauer der Mitosestadien im Quetschpräparat der Wurzelspitze von Vicia faba Mitosestadien

% (von 50)

Prophase

46

Metaphase

22

Anaphase

24

Telophase

8

(Gemessen von: Merle König)

3

Mitosestadien

% (von 53)

Prophase

47,17

Metaphase

22,64

Anaphase

18,87

Telophase

11,32

(Gemessen von: Jana Paul)

Beantwortung der Fragen aus dem Kursskript: Der Aufbau der Metaphasechromosomen aus zwei Chromatiden konnte in den Präparaten erkannt werden und auch die Zahl und Größe der Chromosomen ist erkenn- und bestimmbar. Das Centromer und die Nukleolusorganisatorregion (NOR) konnte man in der Detailbetrachtung erkennen. Die Kernmembran konnte in der Inter-, Pro- und Telophase erschlossen werden. Während der Telophase tritt zudem der Phragmoplast auf, welcher parallel zur Metaphaseplatte in der Äquatorialebene des Zellkerns liegt.

Vergleich der gemessenen Kerngrößen mit den Genomgrößen der einzelnen Spezies: Vergleicht man jeweils Kern- und Genomgrößen von Rattus norvegicus und Vicia faba, ist kein Zusammenhang zwischen diesen beiden Größen zu erkennen, da sich die Kerngrößen zwischen den Spezies zwar relativ stark ähneln, die Genomgrößen jedoch deutliche Unterschiede aufweisen. Außerdem fällt auf, dass sich die Kerngrößen in den unterschiedlichen Geweben und Zelltypen bei Rattus norvegicus deutlich unterscheiden, was darauf hindeutet, dass die Kerngröße eher vom Zelltyp abhängt und nicht von der Größe des Genoms.

4. Kurstag

Thematik des vierten Kurstages war die Untersuchung von Zellbewegung durch Cilien und Flagellen, die Phagozytose bei Paramecium caudatum sowie der Aufbau von quergestreifter Muskulatur. Dafür wurden Kulturen von Paramecium caudatum und Euglena gracilis unter dem Mikroskop beobachtet und die Zeiträume zwischen je zwei Entleerungen der pulsierenden Vakuole von Paramecium caudatum gemessen. Des Weiteren wurde Skelettmuskulatur im Längs- und Querschnitt und Herzmuskulatur im Längsschnitt von Rattus norvegicus untersucht.

4

Tabelle 6: Zeiträume zwischen je zwei Entleerungen der pulsierenden Vakuole von P. caudatum Entleerungen

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Mittelwert

[s]

9

9

10

11

12

9

11

11

12

10

10,4

(Gemessen von: Merle König) Entleerungen

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Mittelwert

[s]

13

10

13

9

13

11

10

12

12

11

11,4

(Gemessen von: Jana Paul)

Zudem wurde die Länge und Breite des Paramecium caudatum sowie der Durchmesser einer pulsierenden Vakuole gemessen, um mit diesen Werten das Volumen des Tieres und einer pulsierenden Vakuole zu berechnen. Zur Berechnung des Volumens des Tieres verwendet man die Formel: 𝑉 𝑍 = 𝜋 × 𝑟² × ℎ (r entspricht der Hälfte der Breite bzw. des Durchmessers und h entspricht der Länge) Zur Berechnung des Volumens der pulsierenden Vakuole verwendet man die Formel:𝑉 𝐾 = 4 3

× 𝜋 × 𝑟3

Die Zeit bis zu einer kompletten Entleerung wird folgendermaßen berechnet: Das Volumen des Tieres dividiert durch das Volumen der pulsierenden Vakuole multipliziert mit dem durchschnittlichen Zeitraum zwischen zwei Entleerungen der pulsierenden Vakuole ergibt die Zeit, in der beide Vakuolen das gesamte Zellvolumen ausgeschieden haben. Dieser Wert wird durch die Anzahl der Vakuolen dividiert. Das daraus resultierende Ergebnis muss nun nur noch in Minuten umgerechnet werden.

Tabelle: Maße und Volumina von Paramecium caudatum und deren pulsierenden Vakuolen sowie Zeit bis zur Ausscheidung des gesamten Zellvolumens Länge des P.

Breite des P.

Durchmesser

Volumen des

Volumen der

Zeit bis zur

caudatum

caudatum

der

P. caudatum

pulsierenden

kompletten

[µm]

[µm]

pulsierenden

[µm3]

Vakuole [µm3]

Entleerung

Vakuole [µm] 120

52,8

14,4

[min] 262747,73

1563,46

14,6

(Gemessen von: Merle König) 5

Länge des P.

Breite des P.

Durchmesser

Volumen des

Volumen der

Zeit bis zur

caudatum

caudatum

der

P. caudatum

pulsierenden

kompletten

[µm]

[µm]

pulsierenden

[µm3]

Vakuole [µm3]

Entleerung

Vakuole [µm] 125

55

12,5

[min] 296978,68

1022,65

27,5

(Gemessen von: Jana Paul)

Zur Untersuchung der Phagozytose wurden drei Tropfen kongorotgefärbte Hefe zu drei Tropfen Parameciensuspension gemischt und im Anschluss die Verfärbung der Phagosomen der Paramecium caudatum beobachtet und in regelmäßigen Abschnitten notiert.

Tabelle: Phagocytose bei Paramecium caudatum Zeit [min]

5

10

15

Rot gefärbte Phagosomen

7

6

5

Blau gefärbte Phagosomen

0

1

2

Zeit [min]

5

10

15

Rot gefärbte Phagosomen

6

8

6

Blau gefärbte Phagosomen

0

1

3

(Gemessen von: Merle König)

(Gemessen von: Jana Paul)

Aufgabe 6: Die Phagosomen erscheinen zunächst rot und verfärben sich nach einer bestimmten Zeit blau. Diese Blaufärbung deutet darauf hin, dass die hinzugegebene Hefe in einer sauren Umgebung verdaut wird. Demnach besteht die ursprüngliche Färbung des Kongorots in einer neutralen oder alkalischen Umgebung fort, verändert sich jedoch sobald sie sich in einem sauren Milieu befindet.

Aufgabe 7: Bei der Beobachtung von Euglena gracilis konnte festgestellt werden, dass sich der Organismus in Richtung des Flagellums bewegt, was bedeutet, dass es sich beim Flagellum um eine Zuggeißel handelt. 6...