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Zusammenfassung für Molekularbiologie ...

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ZF Molekularbiologie

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Molekularbiologie ZF basierend auf Vorlesungsnotizen, Folien und Skript von Johannes Fütterer im FS 2017. Ergänzt mit Wikipedia Artikeln und Youtube Videos (Siehe letzte Seite).

1. DNA und DNA-Techniken Die erblichen Eigenschaften eines Organismus sind in seiner DNA festgelegt. Änderungen der Sequenz oder Struktur können deshalb zu Veränderung dieser Eigenschaften führen. Den phänotypischen Veränderungen, die Organismen und Sorten unterscheiden liegen immer genetische Veränderungen zugrunde. Prokaryonten besitzen einen oder mehrere lineare oder zirkuläre DNA Moleküle, die das eigentliche Genom darstellen und meist mehrere Millionen Basenpaare enthalten. In Form von Plasmiden können sie extrachromosale zirkuläre DNA enthalten. Eukaryonten haben chromosomale DNA im Kern und in den Mitochondiren und Plasitden haben sie auch DNA. Die genomische DNA liegt als antiparalleler Doppelstrang vor, der aus vier Grundbausteinen besteht: Den Nukleotiden (siehe Bild rechts). Ein Nukleotid besteht aus Phosphat, Desoxyribose und einer von vier Basen (Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin). Der Backbone der DNA ist aus Zucker und Phophat aufgebaut. Die zwei DNA-Stränge sind antiparallel. Die Synthese von DNA bewegt sich immer vom 5’-Ende zum 3’-Ende. Im Prinzip sind DNA und RNA gleich aufgebaut, aber in der RNA wird die Base Uracil statt Thymin verwendet. Ausserdem verwendet die RNA im Gegensatz zur DNA Ribose als Zucker. Dieser zweite Unterschied ist sehr klein, aber die OH-Gruppe in der RNA macht einen riesigen Unterschied. DNA ist dadurch viel stabiler als RNA. Die wichtigste Eigenschaft der Nukleinsäuren (=DNA und RNA) ist die Komplementarität. So können stabile Bindungen durch Wasserstoffbrücken zwischen den Basen eingegangen werden. T und A binden zusammen und C und G. Diese Interaktion ist Basenpaarung. Die Summe der Basenpaarungen nennt man Hybridisierung/Annealing/Doppelstrangbildung. Durch diese Eigenschaften kann die Information sehr gut bewahrt werden und Informationen können gut übertragen werden. Die DNA-Stränge sind antiparallel, also das 5’ und 3’ Ende der unterschiedlichen Stränge binden zusammen. Das Zucker-Phosphat Rückgrat ist konstant und bestimmt weitgehend die physikalischen Eigenschaften der DNA. Die Basen ergeben eine sequenzspezifische Oberfläche an der sich die sequenzspezifischen Kontrollereignisse am DNAMolekül abspielen. RNA ist im Prinzip ein einzelsträngiges Molekül, aber es können auch Doppelstränge ausgebildet werden. Unter Umständen entfallen bei der RNA die sterischen Einschränkungen der Doppelhelix und es sind auch andere Basenpaarungen sterisch möglich. Durch die Basenpaarung entsteht eine bestimmte Struktur. Bei t-RNAs hat dies eine besondere Bedeutung. Chromatin ist die biologisch aktive Form der DNA. Chromatin sind sehr lange Fäden. Je nach Zeitpunkt ist die DNA unterschieldich stark verpackt. Die DNA liegt nach der Replikation kurz vor der Zellteilung als Chromosomen vor. Dies ist eine besonders komprimierte Form.

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DNA Techniken Die physikalischen Eigenschaften von DNA sind weitgehend Sequenzunabhängig. Deshalb können die gleichen Methoden überall angewendet werden. Die Interaktion zweier DNA-Stränge ist aber sehr spezifisch, und deshalb können Sequenzen genau unterschieden werden. In den letzten 40 Jahren hat sich die Biologie revolutionär verändert, da neue Methoden möglich sind um mit DNA und RNA zu arbeiten. Es ist heute möglich DNA in kurzen Stücken zu synthetisieren. Erzeugen von DNA Fragmenten durch Zerschneiden • Zufälliges Fragmentieren: Die Länge der Fragmente kann durch die Reaktionsbedingungen beeinflusst werden, aber die genauen Bruchstellen nicht. Die Fragmentgemische, die eine solche zufällige Reakton hinterlässt, eignen sich gut für das Klonieren einen Genoms. Da das Genom immer anderst geschnitten wird, gibt es viele Überlappungen und es kann einfach wieder zusammengesetzt werden. Folgende zwei Mechanismen für das Zufällige Fragmentieren kennt man: o Mechanischischer Stress (z.B. durch Ultraschall) o Enzymatische Behandlung mit unspezifischen DNAsen •

Spezifisches Fragmentieren mit Restriktionsenzymen Enzymatisch durch Restriktionsenzyme: Sequenzspezifische Endonukleasen aus Bakterien. Diese kommen natürlich vor: Die Bakterien können sich so verteidigen gegen Bakteriophagen. Die Phagen-DNA wird von den Enzymen geschnitten aber nicht die eigene, da dort diese Sequenz nicht vorkommt oder durch Methlierung geschützt ist. Erkennungsstellen sind oft Pallindrome (bezogen auf Doppelstrang, dh. ATTA wäre keins, aber ATATATAT wäre eines!) Wichtig: Die Enden sind immer gleich und deshalb kann zusammengefügt werden. Wird in der Mitte geschnitten gibt es glatte enden (blunt ends), sonst gibt es versetzte sticky ends .

Verknüpfen von DNA Fragmenten • Ligation: Durch DNA-Ligasen können Fragmete verknüpft werden, wenn die Enden komaptibel sind. Je nach Enden kann man verschieden kombinieren. Glatte Enden kann man immer verknüpfen, Sticky ends nur wenn sie zusammen passen. •

Topoconing: Topoisomerasen können DNA Stränge schneiden und wieder verknüpfen. Sie bleiben am geformten Ende gebunden. Dies ist eine sehr effiziente Reaktion und es werden keine Restriktionsenzyme benötigt.

ZF Molekularbiologie Geziehlte Vermehrung von DNA Sequenzen • Chemische Synthese: Automatisierte Verknüpfung der Nukleotide •

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Polymerase Chain Reaction (PCR): PCR wird verwendet für Produktion von DNA Fragmenten für Klonierung und Analyse/Nachweis. Die Schritte Denaturierung (95°C), Annealing (52°C) und Synthese (72°C) werden zyklisch wiederholt. Bei jedem Zyklus wird die DNA verdoppelt. Der Trick der PCR-Methode liegt darin, dass hitzestabile Polymerasen, die bei der Denaturierung nicht kaputt gehen, verwendet werden. DNA Polymerasen aus thermophilen Organismen bleiben auch bei hohen Temperaturen stabil. Die Schritte können in gleichen Reaktionsgemisch beliebig oft wiederholt werden und es kann einfach automatisiert werden. Der PCR Primer bindet bis zur «Schmelztemperatur» von ca. 40° (dort würde diese Bindung wieder aufgehoben werden). Primer sind kurze DNA Fragmente mit komplementären Sequenzen zum Ende des gewünschten Stranges. Je länger der Primer, desto spezifischer, denn diese Kombination kommt sehr selten vor. (n=20 etwa) Die Temperatur wird für die Extension erhöht, so gibt es wenig unspezifisches Priming.

Klonierung eines DNA-Fragments Dur Vereinzelung und Vermehrung eines DNA Fragemnts, wird es mit einer vermehrungsfähigen DNA verbunden. Diese nennt man (Klonierungs-)Vektor. •

Klonierung mit Plasmiden: Meist verwendet man als Klonierungsvektoren Plasmide. Plasmide sind extrachromosomale, zirkuläre DNAs (in Bakterien), die sich unabhängig vom Chromosom vermehren. Der ORI (=Origin of Replication) bestimmt die Kopienzahl und die Kompatibilität zu anderen Plasmiden. Ein Plasmid als Klonierungsvektor enthält: (1) Origin of Replication (ORI) (2) Selektionsmarker, meist eine Antibiotika Resistenz (3) Polylinker: DNA Sequenzen für die Insertion

Gut für kurze Fragmente, einfach zu benutzen •

Klonierung mit -Bakteriophagen: Bakteriophagen sind Bakterienviren, die die Bakterienzellen umprogrammieren können, sodass sie neue Bakteriophagen produzieren. E.Coli sind in ihrem typischen Wirtsbereich. Wir können diriekt den Phagen benutzen für die Replikation. Die Strukturen passen gut zusammen, da das Bakterium die cos sites (Verpackungssignale) beinhaltet.

Gut für kurze Fragmente, hohe Effizienz •

Cosmide: Plasmide mit Verpackungssignal von -Bakteriophage Gut für lange Fragmente

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GATEWAY-Technik: Wurde entwickelt aus der -Integrationstechnik

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Artifizielle Chromosomen (BAC & YAC): Für Klonierung grosser Sequenzen werden artifizielle Chromosomen konstruiert, die wie ein zusätliches Chromosom in Bakterien oder Hefe repliziert und vererbt wird. BAC=bacterial artificial chromosome, YAC=yeast artificial chromosome

Gut für lange Fragmente

ZF Molekularbiologie vbeusch Nachweis einer Sequenz Der Nachweis einer Sequenz erfolgt über die Interaktion (Hybridisierung) mit einem Stück komlementärer DNA (Sonde). Dazu muss mindestens ein Teil der Sequenz oder des codierten Proteins bekannt sein. Die Sonde muss markiert werden entweder mit Fluoreszenz oder radioaktiv. Alternativ kann sie mit einer Immunreaktion nachgewiesen werden. •

Southern Blot: Nachweis eines DNA Stücks (1) DNA wird verdaut (2) Fragmente der Grösse nach auftrennen (Elektrophorese) (3) Sichtbar machen durch Färbung oder Hybridisierung

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Northern Blot: Nachweis eines RNA Stücks

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PCR

DNA Sequenzierung • Kettenabbruchmethode nach Sanger: Synthese endet durch statistischen Einbau eines Dideoxynukleotids (ddNTP) statt dNTP. Dort kann dann nicht mehr verlängert werden. Erhaltene Fragmente werden durch Elektrophorese der Länge nach aufgetrennt. Markierung mit fluoreszierender Gruppe an den ddNTPs. Man kann erkennen welche Base am Schluss ist, dort wo die Kette abgebrochen wurde. •

Next Generation Sequencing (Pyrosequencing): In jedem Reaktionsschritt wird nur ein Nukleotid angeboten. Es wir dein Lichtsignal ausgesendet. Die Abfolge der Lichtsignale gibt die Sequenz. Dies braucht keine Gelelektrophorese mehr ondern man misst während dem Sequenzieren.

Anwendungen von DNA Sequenzierung:  Sequenzierung von Genen und Genomen einer Spezies  Liefert Info über Evolution  Sequenzierung verschiedener Genotypen einer Spezies  Korrelation von Eigenschaften und Genvarianten  Sequenzierung der RNA  Genexpression  Sequenzierung eines Ökosystems  Info über Lebewesen in einem System

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2. Stabilität und Variabilität von DNA Diese zwei Kriterien stehen etwas im Gegensatz. Die DNA muss stabil sein, einerseits während der Lebenszeit der Zelle und andererseits muss die Information auch verlässlich weiter gegeben werden zwischen Generationen. Das heisst es müssen Schäden repariert werden, die Replikation muss genau abfolgen und die Verteilung bei der Zellteilung und Gametenbildung muss stimmen. Aber wenn DNA völlig stabil wäre, gäbe es keine Entwicklung. Deshalb müssen Varianten erzeugt werden und sich an die Umweltveränderungen anzupassen.

Replikation Enzymatische DNA Synthese Die gesamte DNA muss bei jeder Zellteilung repliziert und auf die beiden Zellen genau verteilt werden. Die Genauigkeit stammt aus den Eigenschaften des DNA-Moleküls. Es passt jeweils nur eine Base genau an einen Ort. DNA Polymerasen synthetisieren die DNA indem sie dNTP (Deoxynucleosid-Triphosphat) in 5’-3’ Richtung einbauen. DNA Polymerasen benötigen einen Matrizenstrang und einen Primer, der eine 3’OH Gruppe für den Synthesebeginn zur Verfügung stellt. DNA Polymerasen können falsch eingebate Nukleotide wieder entfernen. Diese Korrekturfunktion führt zu einer niedrigen Fehlerrate. Falscheinbau kann durch Zufall erfolgen oder auch durch Tautomere Basenformen (Tautomere = chemisch identische aber strukturell verschiedene Formen der Nukleotidbasen) Es gibt verschiednene Polymerasen. A,B,C DNA Polymerasen sind besonders genau. X DNA Polymerasen machen etwas mehr Fehler und wirken hauptsächlich in Prozessen in denen erhöhte Variabilität beabsichtigt ist (Produktion von Genen für Antiköprper, …). Nur DNA Polymerasen der Y Familie (Notfall Polymerasen) können über falsche Positionen hinweglesen. So kann sich eine Zelle trotzdem fortpflanzen aber es werden Mutationen ins Genom eingeführt. Zellzyklus Alle Zellen, die sich vermehren durchlaufen einen geordneten Zellzyklus. In der G1-Phase läuft das in der DNA kodierte Arbeitsprogramm ab. Der Übertritt in die S-Phase ist genau reguliert. In der S-Phase wird die DNA repliziert und jedes Chromosom verdoppelt. Die Replikation beginnt am Origin of Replication. Am Origion of Replication bilden sich Replikationskomplexe, die in Replikationsgabeln von Origin wegwandern und dabei die DNA verdoppeln. Wegen der Synthese in 5’-3’-Richtung kann nur einer der Stränge kontinuierlich synthetisiert werden (leading strand) und der andere (lagging strand ) wird nur stückweise synthetisiert (Okazaki Fragmente) Für die Okazaki Fragmente müssen Primasen und Ligasen mithelfen. Eine ganze Reihe von anderen Proteinen wird auch benötigt. Helicasen zum Beispiel wirken beim Aufwinden des DNA Strangs und Topoisomerasen lösen den torsionalen Stress auf. In der G2-Phase werden Schäden korrigiert und in der Mitose wird die DNA auf die zwei Zellen verteilt. In der Meiotischen Teilung werden die replizierten Chromosomen so aufgeteilt, dass am Ende diploide Zellen entstehen. Fehler in diesem Prozess führen zu Chromosomenabnormalien. In der Regel führt Replikation zu einer präzisen Verdoppelung des genetischen Materials. Das Ende des Stranges kann eigentlich nicht repliziert werden und so verkürtzt es sich bei jeder Replikation etwas. Nach einer grossen Anzahl Vermehrungen können Zellen so unfunktional werden (replikative Seneszenz). Telomere haben die Funktion

ZF Molekularbiologie vbeusch die Enden wieder zu replizieren. Telomere dienen ausserdem dazu, die DNA Stücke, die durch Strangbruch entstanden sind zu unterscheiden. Die Zellen haben einen Selbstmord-Mechanismus (Apoptose), der verhindert, dass völlig geschädigte Zellen überleben.

Mutation Fehler in der DNA Struktur können verschiedne Gründe haben. Einerseits kann fehlerhaft repliziert werden. Mutationen können auch durch Umwelteinflüsse, wie Strahlung, passieren. Diese erfolgen in der Natur aber können auch künstlich herbeigeführt werden. Stoffe die zu solchen Veränderungen führen, werden Mutagene genannt. • • •

Elektomagentische Strahlung (UV, Röntgen, α, , , …) Chemikalien Radikale, Aktiver Sauerstoff, polycyclische Aromaten, Alkohol, Hitze, pH, …

Manche dieser Stoffe führen zu chemischen Veränderungen, sodass sich die Basenpaarung ändert und somit auch die DNA Sequenz (Es entstehen Tautomere). Andere lagern sich zwischen Basenpaare oder binden kovalent an Basen (DNA Addukte). So wird die Replikation und die Expression gestört. Die Mutagenität von Chemikalien kann mit einem Ames-Test getestet werden. Hierfür werden Bakterien mit einem Gendefekt dem Mutagen ausgesetzt. In einigen von ihnen hebt sich der Gendefekt dann wieder auf und die Bakterien können sich replizieren. Je mehr Bakteren sich replizieren, desto mutagener ist die Substanz. Manchmal muss nicht ein einzelner Stoff sondern auch die Stoffwechselprodukte der Substanz getestet werden, da manche Stoffe erst im menschlichen Körper zu Mutagenen umgesetzt werden. Dazu werden Leberextrakte der Maus verwendet. Alternativ kann der Test auch direkt in einem Säugetier durchgeführt werden. Man benutzt Mäuse, die einen lac Repressor enthalten. Das lac Operon kann so nicht exprimiert werden. Da die Tests mit hohen Mutagenkonzentrationen durchgeführt werden ist es schwierig abzuschätzen ob eine natürliche Dosis schädlich ist. Vor allem Mutationen, die den Zellzyklus beeinflussen sind gefährlich, da so Krebszellen entstehen können. In der Nahrung gibt es auch Antimutagene. Gewisse Aufnahme von Mutagenen ist unausweichlich.

Reperatur Zum Glück gibt es Reperaturmechanismen. Bei der «Mismatch Repair » ist es wichtig, dass erkannt wird, welches der richtige Strang ist, damit nicht der falsche korrigiert wird. In E.Coli geschieht dies duch Methylierung des Elternstrangs. Der neue Strang ist noch nicht methyliert. (siehe Bild rechts) Energiereiche Strahlung kann zu Dopelstrangbrüchen führen. Hier werden gleich beide Stränge geschädigt und brechen auseinander. In diploiden oder polyploiden Zellen kann das Schwesterchromosom zur Reperatur verwendet werden. Dies nennt man homologe Rekombination.

Dabei können gewisse Allele verloren gehen, wenn die Sequenz des anderen Alles zur Reperatur verwendet wird. Dieser Prozess heisst Genkonversion.

Non-homologous Endjoining (NHEJ) ist ein weiterer Reperaturmechnismus für Doppelstrangbrüche. Hier geht meistens DNA verloren und zumindest das Gen an der Bruchstelle wird zerstört aber wenigstens entstehen funktionale Chromosomen. Wenn gleichzeitig mehrere Brüche passiert sind, kann es zu falscher Rekombination kommen. Chromosomenumlagerung kann harmlos sein aber auch zu gewissen Krankehiten führen. NHEJ hat

ZF Molekularbiologie vbeusch ausserhalb von Reperaturprozessen die Funktion, dass sie bei der Bildung der Gene von Antikörpern für eine geiwsse Variabiltät sorgt. Krebszellen haben normalerweise Mutationen, die die Zellteilungskontrolle beeinträchtigen. Sie sind aber besonders anfällig auf Mutationen und man versucht sie deshalb noch mehr Mutagenen auszusetzen, damit die Zellfunktion irreversibel gestört wird.

Genomstruktur und Genomvariabilität Der erblich fixierte Austausch einzelner Basen führt zu Punktmutationen (SNP = single nucleotide polymorphism). Insertionen und Deletionen führen zu Indels. In der Evolution und auch in der Züchtung sind Mutationen die Grundlage für die Entstehung von Variabilität. Die Veränderung von Genomen durch Mutagenese spielt eine grosse Rolle in der Züchtung. Mutation erfolgt durch Behandlung mit Chemikalien oder Bestahlung. So kann die genetische Variabilität erhöht werden. Die meisten Mutationsmethoden sind nicht zielgerichtet und es geschehen Mutationen irgendwo im Genom. Es muss also darauf geachtet werden, dass das einzelne Individuum nicht mit zu vielen Mutationen belastet wird. Mithilfe von molekularen Analysemethoden kann man heute interessante Mutationen identifizieren. Bis jetzt wurden Mutationen von einzelnen Basen beschrieben. Es gibt in den meisten Eukaryontischen Zellen eine grosse Zahl von beweglichen Elementen (Transposons), die ebenfalls zu Genomveränderungen führen können. Die meisten funktionalen DNA Sequenzen kommen im Genom nur einmal vor (single copy). Es gibt auch mittel repetitive DNA und hoch repetitive DNA, die wahrscheinlich strukturelle Funktionen hat. Zur mittel repetitiven DNA gehören Transposons. Sie machen einen grossen Teil der eukarontischen Genome aus. Transposition kann zu Geninaktivierung oder auch zur Genaktivierung führen. •

Inverted Repeat Transposons: Die Transposons haben flankierende inverted repeats und können so ausgeschnitten werden. Nach dem Ausschneiden bleibt immer ein kleiner Footprint zurück und die DNA ist nicht unverändert.

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Retrotransposons: Retrotransposons sind Retroviren ohne extrazelluläre Phase. Sie produzieren eine neue Kopie, die anderswo integriert wird, aber die alte Kopie bleibt am Platz. Das RNA Molekül, dass von dem ursprünglichen Gen abgelesen wird, wird vom Enzym Reverse Transkriptase in ein DNA Molekül umgeschrieben. Dadurch, dass am Anfang und am Ende ein direct Repeat auftritt, kann das Ende verwendet werden um den Promoter am Anfang zu schreiben.

Genomevolution durch Sequenzduplikation Die bisher behandelten Prozesse erklären aber nicht, wie im Laufe der Evolution neue Gene entstanden sind, oder wieso sich der DNA-Gehalt verschiedener Oragnismen so stark unterscheidet. Im Laufe der Entwicklung der Eukaryonten haben nachweislich mehrere Gen- und Genomverdoppelungen stattgefunden. Solche Genomveränderungen geschiehen andauernd, aber es enstehen keine konkurrenzfähigen Organismen. Aber die grossen Genomverändeurngen wurden in Perioden der Erdgeschichte datiert, in denen ein Grossteil der Organismen ausstarb. Wahrscheinlich erlaubten diese neu entstandenen ökologischen Nischen die Etablierung neuer Arten.

ZF Molekularbiologie vbeusch Auch lokale Duplikationereignissse spielen eine Rolle bei der Genomevolution. Unequal Crossing-over ist crossingover an homologen Regeionen an verschiedenen Genompositionen. Dies führt zu Neukombination von Genomteilen. Domain shuffling ist die Vermehrung und Neukombination von DNA Regionen, die für Protein Domänen kodieren. In den nicht-kodierenden Bereichen unterscheiden sich Genome am stärksten. Die Genomgrösse korreliert nur schwach mit der Genzahl.

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