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UE1 – Hybridation moléculaire

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Hybridation moléculaire Pour analyser une population d’ADN complexe : soit amplification (PCR, clonage), soit hybridation moléculaire. Elle ne permet pas de séparer un morceau d’ADN de l’ensemble du génome mais de le repérer. C’est une méthode de détection. Hybridation moléculaire basée sur la capacité des acides nucléiques d’un ADN simple brin à s’associer pour former un double brin. Cette association se fait par complémentarité des bases : A-T : 2 liaisons hydrogène C-G : 3liaisons hydrogène Dans la technique d’hybridation on utilise des fragments d’acides nucléiques marqués qui sont appelés des sondes. Ces sondes sont mises dans un milieu complexe qui comprend de nombreux acides nucléiques non marqués. La sonde ne s’associe qu’avec la portion strictement complémentaire d’acides nucléiques appelée cible. La sonde va permettre de mettre en évidence la séquence qui lui est strictement complémentaire.

I.

Fusion et hybridation moléculaire

L’ADN double brin peut être dénaturé en ADN simple brin - Par chauffage supérieur à la température de fusion Tm - Avec un agent dénaturant comme la soude L’ADN simple brin s’il est placé immédiatement dans la glace après le chauffage, va rester simple brin. Sinon au cours du refroidissement l’ADN va se réapparier de façon complémentaire avec les liaisons hydrogène. C’est ce qui est spécifique à l’hybridation. Donc hybridation se produit qd on se retrouve en dessous de la température de fusion. Il est possible de suivre la séparation du double brin d’ADN : les simples brins absorbent à une longueur d’onde plus élevée que l’ADN double brin.

II.

Facteurs de l’hybridation

Température de fusion : quand on chauffe l’ADN on aura 50% de l’ADN sous forme double brin et 50% sous forme simple brin. Plus on a de G-C plus la Tm (température de fusion) sera élevée. Température de dénaturation est généralement de 87°C. On peut avoir des rappariements à des températures inférieures à Tm. Chaque ADN a une Tm qui lui est propre. Concentration en ADN : quand on veut réassocier 2 fragments d’ADN plus leur concentration est élevée dans le milieu plus le réappariement va être facile. Et inversement Temps : la réassociation implique que les 2 brins soient face à face. Elle est favorisée par le temps Complexité des séquences : chaque ADN a une température de séquence qui lui est propre. En effet plus il y aura de séquences G-C et plus la dénaturation sera lente. Si la cible est isolée au milieu d’un grand nombre de séquence le temps de réappariement sera plus long. Si on a uniquement 2 fragments complémentaires ils vont se réapparier immédiatement.

UE1 – Hybridation moléculaire

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Température : la plus forte vitesse de réassociation est généralement observée pour des températures d’environ 25% inférieures à la valeur du Tm (souvent autour de 55-60°C) de la séquence considérée. Au-dessus de la Tm il n’y a pas d’appariement A la température Tm il y a appariement spécifique En dessous de la température Tm on observe des mésappariements La force ionique (stringence-> stringent = rigoureux, strict) : pour qu’une hybridation se produise il faut qu’il y ait dans le milieu une concentration en ions (Mg le plus souvent, NaCl) suffisante. On peut jouer sur cette hybridation en modifiant la force ionique. Force ionique faible = forte stringence = peu d’ions dans le milieu on aura une hybridation spécifique, on est donc peu permissif. Force ionique élevée = faible stringence = plus de sel dans le milieu, on est tolérant et on va supporter des mésappariements. On peut ainsi par exemple se faire s’apparier des sondes issues de souris sur le génome humain. Conditions stringentes = conditions strictes. On peut jouer sur la force de l’hybridation

II.

Les différents types d’hybridation A. Phase liquide

Les séquences complémentaires dont on désire obtenir l’hybridation sont dans une solution tampon. Les séquences se rencontreront facilement et on aura des températures d’hybridation autour de 55-60°C. Des petites sondes courtes sont capables de se fixer sur l’ADN. Exemple : PCR. Des amorces vont venir s’apprier sur l’ARN.

B. Support solide La cible est immobilisée sur une phase solide. On va mettre la sonde en présence de la cible. On va pouvoir éliminer toutes les séquences non hybridées. On peut fixer la cible sur une membrane (nitrocellulose, nylon), sur du verre, sur des colonies bactériennes qui contiennent de l’ADN, sur des chromosomes en métaphase, sur des coupes de tissu… Objectif : détecter la présence d’un acide nucléique d’une séquence donnée par l’utilisation d’un fragment d’ADN complémentaire = sonde.

IV.

Applications de l’hybridation

(PCR en milieu liquide.)

A. Hybridation d’ADN sur support solide : southern blot Procédure : 1. on extrait l’ADN 2. on coupe l’ADN par les enzymes de restriction génère bcp de fragments 3. on sépare les fragments par électrophorèse en fonction de leur taille et de leur PM 4. on transfère ces fragments en milieu dénaturant sur support solide (sur une membrane) 5. on procède à l’hybridation après traitement à la soude pour rendre l’ADN simple brin 6. on lave et on obtient uniquement les fragments hybridés, et enfin on les révèle car la sonde est marquée l’idée est de repérer, non de séparer. Permet de repérer des grands fragments. ADN se dénature en solution alcaline. L’ADN migre par capillarité grâce au tampon. Dans le gel, l’ADN est trop compact, pas accessible alors qu’après, dans la membrane, l’ADN est beaucoup plus accessible. Utilisée en diagnostic, notamment pour le syndrome de l’X fragile. On peut rechercher des anomalies dans un gène car on est capable de repérer des délétions, des anomalies de coupure, des empreintes génétiques. Aujourd’hui la PCR a beaucoup remplacé la southern blot. Si on a une anomalie sur un site de restriction il n’y aura pas coupure et le fragment repéré sera plus grand.

UE1 – Hybridation moléculaire Si on a une délétion les sites petit fragment. Individu hétérozygote, ho-

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de restriction seront rapprochés et on aura un plus mozygotes peuvent être repérés.

La RFLP est basée sur le fait que la sonde va repérer uniquement le fragment qui se situe entre 2 fragments de restriction. Il existe des individus qui portent un polymorphisme SNP et dans ce cas, on a plus de site de restriction. Et donc si on a pas de coupure, l’enzyme va être bornée par une plus grande séquence et donc on aura un fragment plus grand. Technique qui permet donc de repérer des polymorphisme.

B. Hybridation d’ARN sur membrane northern blot Procédure : La cible est cette fois l’ARN et non pas l’ADN : donne des infos sur l’expression d’un gène. 1. On extrait de l’ARN à partir d’un tissu donné 2. On le sépare par électrophorèse 3. On transfère l’ARN sur une membrane 4. On fait une hybridation, des lavages, une révélation. Permet de déterminer le tissu dans lequel s’exprime un gène, donner la taille de l’ARN, déterminer l’épissage alternatif ( on peut ainsi déterminer des variants d’épissage). Attention : pas besoin d’une dénaturation car l’ARN est déjà simple brin.

C. Hybridation d’ADN in situ : FISH Souvent les sondes sont fluorescentes et peuvent être appliquées sur des chromosomes en métaphase. On peut chercher des cassures de gène et localiser les gènes. Ces sondes peuvent être utilisées pour détecter des syndromes où il y a des délétions de chromosomes (Prader-Willi) On peut aussi repérer la présence de virus (virus d’Epstein Barr) dans un tissu : il présente une séquence d’ARN il suffit d’avoir une sonde complémentaire de cet ARN viral et voir les cellules qui le contiennent et celles qui ne le contiennent pas....