12. Transporte mediado PDF

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Biofísica - Membranas y transporte...

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Tema 12. Transporte mediado: Lo que sabemos es que el flujo del transporte está determinado por su fuerza impulsora y estos nos sirven para saber la probabilidad de que el flujo de agua arrastre solutos. La estrategia que tenemos que seguir es la de la simplificación, para reducir el nº de fuerzas impulsoras y dar un significado a los procesos fenomenológicos.

Hipótesis del transportador: Históricamente, sin saber cómo eran las proteínas de membrana ni cómo están ubicadas, se sabían los parámetros cinéticos que tenían. Se tenía una idea de que existía un transportador. Esta hipótesis postula la existencia en las membranas de macromoléculas, que serían capaces de unirse específicamente a ciertos sustratos y transportarlos a la otra cara de la membrana. En los años sesenta se aislaron algunas proteínas a partir de bacterias gram-negativas que fueron identificadas como transportadores. Las principales pruebas de que las proteínas aisladas eran realmente los transportadores son: 1. El choque osmótico, en condiciones controladas libera proteínas capaces de unirse al sustrato sin producir lisis celular. Las células desprovistas de estas proteínas no son capaces de transportar el sustrato en cuestión. 2. Se han obtenido mutantes transporte-negativos que carecen de las correspondientes proteínas en bacterias. 3. Si se conseguía identificar y purificar alguna de las proteínas se podía calcular la constante de disociación (KS) del complejo proteína-ligando. In vitro estos parámetros de unión (KS) eran análogos a los parámetros cinéticos asociados al proceso de transporte. La cinética del transporte se puede explicar como una cinética enzimática, solo que se da un cambio de orientación del sustrato. 4. En años más recientes se ha conseguido aislar, purificar e introducir estas proteínas transportadoras en el seno de bicapas lipídicas y reconstituir así vesículas capaces de efectuar el transporte. Se ponía la proteína en un entorno en el que estaba ella sola y en el que podía operar, y se veía si se podía observar la actividad transportadora de la célula Desde el punto de vista de la cinética se podía estudiar la cinética de la unión del sustrato con el transportador, aunque no pudieran identificar totalmente ese transportador. Más tarde, se hicieron experimentos para intentar aislar proteínas involucradas en el transporte en organismos, o en tejidos, o en una fuente natral rica en ese transportador. Por eso, las primeras en estudiarse fueron la ATPasa de sodio y potasio, ATPasa de calcio y magnesio, la proteína intercambiadora de aniones, la rodopsina, la ATP translocasa y el receptor colinérgico de acetilcolina (importante en sinapsis). Estos fueron los primeros en conocerse y fueron de las que se obtuvieron las primeras informaciones cinéticas, pero sin tener idea de su estructura. De la que más información se tiene es de la ATPasa de calcio del retículo sarcoplasmático, denominado, de manera abreviada, SerCa. La cinética puede postular un mecanismo que se lleva a cabo en varios pasos. Esos pasos, muchos hipotéticos, tienen cierta base en experimentos cinéticos, pero si se quieren asociar a lo que realmente ocurre en la proteína, y a cada uno de los intermediarios de acción de la cadena de trabajo que realiza, debería poderse sacar una foto a cada uno de esos intermediarios. Del único que se tiene un número suficiente de instantáneas analizadas por difracción de rayos X es de SerCa. 123

Biofísica

Características comunes: o o

o o

Suelen ser proteínas integrales de membrana, que atraviesas la bicapa lipídica en su totalidad. Suelen poseer estructura cuaternaria, lo que facilita el control alostérico del proceso. Si tienen varios centros de unión habrá un alosterismo positivo. Por otro lado, también es posible que el centro activo se halle en la interfase entre dos subunidades. El movimiento de soluto está ligado a cambios conformacionales, excepto en los canales, en los cuales los cambios conformacionales están ligados a la regulación de acceso del tránsito por el canal. Existencia de residuos glucídicos en el exterior; es decir, que son glicoproteínas. Probablemente estos azúcares son añadidos después de que la proteína sintetizada haya sido incorporada a la membrana, quizá con el fin de estabilizar su conformación. De cara a la purificación, se puede aprovechar la afinidad a estos residuos con sustancias como la concabalina A.

Test ab-inicio: Coeficiente Q10: Distinguir un transporte por difusión simple de un transporte mediado es muy útil, ya que a menudo resulta necesario, desde un punto de vista experimental, distinguir entre flujos pasivos y flujos mediados sin romper la célula. Un método práctico para distinguir entre ambas especies de fenómenos es la utilización del llamado Coeficiente Q10 (coeficiente de temperatura del proceso). El Coeficiente Q 10 es una prueba en la que se mide la distribución de energía cinética entre las moléculas a una determinada T y a 10 grados mayor que esa T. Lo que se calcula, por tanto, es el número de moléculas de total (NE) que tienen una energía (E) mayor que la energía de activación (energía umbral) del proceso de transporte (U, energía cinética) a esa T determinada; es decir, tienen la energía suficiente para que se dé el transporte en esas condiciones de T. Según la distribución de Boltzmann: 𝐸⁄ 𝑘𝑇

𝑁𝐸 = 𝑁𝑡 ∙ 𝑒 −

Donde N t es el número total de moléculas, y k es la cte de Boltzmann (8,617x10-5eV/molécula xo K)

Las colisiones hacen perder o ganar energía a las moléculas, al azar; pero al aumentar la T (T+10), aumenta el movimiento de las moléculas, es decir, aumenta la energía. En consecuencia, a T+10 hay un mayor número de moléculas que sobrepasan U. En el caso de la difusión a través de una membrana, el número de moléculas con una energía cinética es proporcional a: 𝑈⁄ 𝑘𝑇

𝑁𝐸 = √𝑇 ∙ 𝑒 −

A menudo se requiere salvar una "barrera" de energía (UB) para difundir. Según Boltzmann, el número de moléculas con esa energía será: 𝑈𝐵

𝑁𝑈𝑇𝐵 ∝ √𝑇 ∙ 𝑒 −

⁄𝐾𝑇

Y a una T 10 veces más alta (T+10): 𝑁𝑈𝑇+10 ∝ √𝑇 + 10𝑒 𝐵

𝑈 ⁄ − 𝐵 𝐾(𝑇+10)

Así pues, el cociente entre las dos es el llamado Q10 o coeficiente de tª del proceso: 124

Biofísica ⁄

10𝑈𝐵 𝑇 + 10 𝑘𝑇(𝑇+10) 𝑄10 = √ ∙𝑒 𝑇 La manera en la que emplearemos este cociente será mediante la ecuación:

𝑄10 =

(𝑇+10)

𝑁𝐸

𝑁𝐸

(𝑇)

Analizando los valores de Q10 podemos decir de qué tipo de transporte se trata: 1. Si Q10=1, significa que UB es my bajo, prácticamente cero y ese es el caso de la difusión simple, porque la difusión simple es un proceso espontáneo y no está participando ninguna proteína y la energía de activación asociada es muy baja. 2. Si Q10 es igual o mayor que 2, tengo participación proteica; es decir, transporte mediado. 3. Si 1< Q10 < 2, tendríamos duda de si estamos con transporte espontáneo; es decir, difusión simple de moléculas cargadas. Con estos valores tendríamos que ajustar un poco más, y, para ello, tendríamos que hacer flujo en función de concentración de sustrato para ver las gráficas que dan: línea recta o función saturable. Este método del Q10 a facilitado mucho las cosas, porque si no para saber de qué tipo de transporte se trata se deberían realizar cinéticas de saturación. Independientemente de la magnitud, si se trata de una difusión simple, una representación de flujo o velocidad frente a concentración del compuesto que se está transportando va a dar siempre una línea. Sin embargo, si es un transporte mediado, va a haber una saturación.

Transporte mediado: El transporte que se verifica a través de proteínas transportadoras específicas, capaces de realizar la translocación de sustancias químicas a un lado y al otro de la membrana, recibe el nombre de transporte mediado. La interacción de las proteínas transportadoras con las moléculas transportadas se puede describir exactamente en los mismos términos de interacciones macromolécula-ligando que se aplican a las interacciones enzimasustrato. Así pues, la mayoría de los conceptos y ecuaciones de la cinética enzimática se aplican por igual al transporte mediado. Características: Experimentalmente, el transporte mediado puede distinguirse fácilmente de la difusión simple por algunas propiedades fácilmente comprobables: 1. Es específico para ciertos sustratos, pudiendo incluso llegar a distinguir hasta isómeros. 2. Es saturable; es decir, alcanza un flujo máximo (Jmáx) que no aumenta aunque aumente la concentración de sustrato. 3. Existe una temperatura máxima para el proceso, por encima de la cual las moléculas del transportador sufren una desnaturalización térmica. 4. Es susceptible a la inhibición (NEM). La NEM actúa sobre grupos tioles de los puentes disulfuro que, a veces, abundan en el centro de unión al sustrato. Puede ser competitiva, no competitiva y acompetitiva. Estas propiedades son consecuencia directa del carácter proteico de los transportadores y son comunes a las enzimas. 125

Biofísica Cinética: Ecuación de flujo inicial: En nuestras consideraciones cinéticas sobre un transporte mediado de una sustancia de un compartimento A a otro B sólo tendremos en cuenta el flujo inicial. Se considera flujo inicial el flujo de sustrato de A a B cuando la concentración de dicho sustrato en B es nula y, por tanto, el flujo de B a A también lo es. La utilización de isótopos radiactivos permite medir flujos iniciales incluso cuando existen concentraciones medibles en ambos compartimentos. Sea una suspensión de células que incorporan un sustrato por medio de un transportador específico: si CT es la concentración total de moléculas de transportador y CS la concentración de moléculas (transportador) unidas al ligando (sustrato), el flujo de sustrato al interior de la célula será: 𝐽 = 𝑘𝑆 ∙CS

Donde kS es una cte de velocidad (T-1)

Cuando todos los transportadores se hallan unidos al sustrato, es decir, en el caso de saturación del sistema, 𝐽 = 𝐽𝑚𝑎𝑥 y 𝐶𝑆 = 𝐶𝑇 : 𝐽𝑚𝑎𝑥 = 𝑘𝑆 ∙ 𝐶𝑇

En general:

𝑱(𝒇−𝒅) = 𝑱 𝒎𝒂𝒙 ∙

[𝑪𝑺] 𝑪𝑻

(1)

Para 1 sustrato: En la situación en la que un transportador, con el centro de unión al sustrato localizado en la superficie celular, puede unirse a las moléculas de sustrato en disolución. No va a haber un sustrato y un producto, sino que en ambos lados habrá sustrato (S). El proceso de unión puede describirse por este equilibrio sencillo: 𝐶 + 𝑆𝑓

𝑘1

→ ←

𝑘2

𝑘𝑆

𝐶𝑆 → 𝑆 𝑑

Donde C es el transportador, Sf es el sustrato fuera y Sd el sustrato dentro

Como hemos supuesto condiciones de equilibrio la constante Ks del sustrato S con respecto a su transportador tiene el significado de una constante de equilibrio. Hay que decir que el segundo paso de la reacción es más lento comparado con el primer paso. Ambos están relacionados mediante la siguiente ecuación: 𝑲𝑺 =

𝒌𝟐 𝑪 · 𝑺 = 𝑪𝑺 𝒌𝟏

Donde KS es la contante de equilibrio o de disociación de la reacción, k 1 es la cte de formación del complejo y k2 la de disociación del complejo.

Teniendo en cuenta que 𝐶𝑆 =

𝐶∙𝑆 𝐾𝑆

y que 𝐶 + 𝐶𝑆 = 𝐶𝑇 , lo integramos en la ecuación del flujo inicial vista

anteriormente (1), y obtenemos que:

126

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Equilibrio dinámico:

𝑱(𝒇−𝒅) = 𝑱 𝒎𝒂𝒙 ∙

[𝑺] 𝑲𝑺 +[𝑺]

(2)

Como hemos supuesto condiciones de equilibrio la cte de disociación de la reacción (KS) tomaba significado de una cte de equilibrio (KS= k2/k1). Sin embargo, el centro de unión del transportador no permanece en la superficie externa de la célula, por lo que no se establece un verdadero equilibrio, como el descrito. La situación puede describirse con más exactitud en términos de un equilibrio dinámico que se insatura para cada [S]. En este equilibrio dinámico (steady state), como en el equilibrio termodinámico o verdadero, las concentraciones de los reactantes permanecen constantes, solo que hay una transferencia neta de S a uno de los compartimentos (con producción de entropía). Podemos derivar la ecuación de flujo inicial (1) basada en relaciones de equilibrio:

Al estar en el equilibrio dinámico esto es cero:

𝒅[𝑪𝑺]

Sustituyendo en la ecuación de flujo inicial (1):

𝒅𝒕

=𝟎 y

Obtenemos que: 𝑱(𝒇−𝒅) = 𝑱 𝒎𝒂𝒙 ∙

[𝑺] 𝑲𝑴 +[𝑺]

(3) ; siendo 𝑲𝑴 =

𝒌𝟐 +𝒌𝒔 𝒌𝟏

KM es similar a la cte de Michaelis en la cinética enzimática. Dividiendo por la unidad los dos miembros de la ecuación (2) se obtiene una ecuación lineal cuya representación gráfica es la de doble recíproca o Lineweaver y Burk. Esta representación es útil para obtener KM y Jmax. 𝟏 𝟏 𝑲𝑴 𝟏 = ∙ + 𝑱 𝑱𝒎𝒂𝒙 𝑱𝒎𝒂𝒙 𝑺

Al realizar una representación de 1/J frente a 1/S, obtengo que el corte de la ordenada es el inverso del flujo máximo, y de la pendiente obtengo el parámetro de Km y de flujo máximo. Varios sustratos: Consideramos ahora un situación en la que, además del sustrato S, existen también otros sustratos, A y B, por lo que el transportador tiene una cierta afinidad. Estos nuevos sustratos actúan como inhibidores competitivos del transportador. 127

Biofísica De nuevo deseamos obtener una expresión para el flujo unidireccional de S. Suponiendo condiciones de equilibrio (para los sustratos S, A, B,...Z), tenemos que: 𝐶𝑆 =

𝐶∙𝑆 𝐾𝑆

; 𝐶𝐴 =

𝐶∙𝐴 𝐾𝐴

; 𝐶𝐵 =

𝐶∙𝐵 ;... 𝐾𝐵

𝐶𝑍 =

𝐶∙𝑍 𝐾𝑍

(a)

Como CT= 𝐶 + 𝐶𝑆 + 𝐶𝐴 + 𝐶𝐵 + ⋯ . 𝐶𝑍, sustituyendo este CT en la ecuación (1):

(b) Sustituyendo (a) en (b): 𝑱(𝒇−𝒅) = 𝑱 𝒎𝒂𝒙 ∙

[𝑺] 𝑲 𝑲 𝑲 𝑲𝑺 + 𝑺 𝑨+ 𝑺 𝑩+⋯+ 𝑲𝑺 𝒁+[𝑺] 𝑲𝑨

𝑲𝑩

𝒁

(4)

Una gráfica de dobles recíprocas permite una estimación geométrica de la constante aparente (K ap): 𝑲𝒂𝒑 𝟏 𝟏 𝟏 + ∙ = 𝑱 𝑱𝒎𝒂𝒙 𝑱𝒎𝒂𝒙 𝑺

Siendo: 𝑲𝒂𝒑 = 𝑲 𝑺 +

𝑲𝑺 𝑲𝑺 𝑲𝑺 [𝒁] [𝑩] + ⋯ + [𝑨] + 𝑲𝒁 𝑲𝑩 𝑲𝑨

Cuando en un experimento in vitro se estudia una pareja de sustratos (S y A), KS y KA se pueden obtener representando Kap en función de [A]: En ese caso 𝐾𝑎𝑝 = 𝐾𝑆 +

𝐾𝑆 [𝐴] 𝐾𝐴

La KM es importante y nos dice entre otras cosas cual va a ser el sustrato natural. El sustrato natural cuando hay varios que pueden ser cogidos por el enzima va a ser aquel que tenga una Km menor, es decir, que tenga mayor afinidad. Si miramos el transporte de glucosa, el transportador tendrá también afinidad por otros enzimas, estos serán inhibidores competitivos del transporte de glucosa. Si las pendientes son paralelas, la pendiente es igual a la Vmax inhibición competitiva (por ejemplo la maltosa) En resumidas cuentas: haces la gráfica para cada sustrato y luego comparas la KM en cada uno, el de menor KM será el sustrato natural del enzima. Representaciones y significado: Vamos a considerar cuando haya un solo inhibidor. Sabemos que estos son de tres tipos: competitivos, no competitivos y acompetitivos. Las representaciones son: 1. La doble inversa, en la que se representa el inverso de la velocidad frente al inverso de la concentración de sustrato de aquello de lo que supongo que estoy midiendo el transporte. La pendiente es igual a KM/Vmáx, y del corte en la ordenada tengo -1/KM. 2. La representación de Eadie-Hofstee, que es flujo frente a flujo/concentración de sustrato. 3. La de Dixon, que es concentración de sustrato/flujo frente a concentración de sustrato. 128

Biofísica Son diferentes formas de representar basándonos siempre en la ecuación de Michaelis-Menten. Usamos una u otra por comodidad, cuando intuimos que hay un inhibidor. La ventaja es que cuando se trabaja con inhibidores, hay representaciones en las que es muy fácil identificar el tipo de inhibición según los valores de los parámetros: 1. Inhibición competitiva: no varía la Vmáx y sí la KM. 2. Inhibición no competitiva: varía la Vmáx, pero no la KM. 3. Inhibición acompetitiva: disminuyen ambos parámetros. Ejemplo. Equilibrio dinámico: El primer ejemplo es el de un canal transmembranal, el ionóforo formado por el dímero del péptido gramicidina; el cual tiene un flujo dependiente del tamaño de las moléculas. Se ha utilizado como ejemplo de canal durante muchos años. Se enfrenta el cociente de la conductancia (G) y el coeficiente de permeabilidad del soluto (pS) frente a la actividad. Cuanta más alta se encuentre la representación, más permeable será el soluto. En la imagen de la izquierda, se miden gradientes de diferentes combinaciones del cloro con cationes: sodio, potasio y cesio. Se observa la menor permeabilidad para el caso del sodio y, por tanto, transporte. Llama la atención, ya que tiene un tamaño menor al de los otros dos cationes. La razón radica en que estos cationes atraviesan el canal de forma deshidratada y el sodio requiere una energía de deshidratación mucho mayor. En las dos imágenes superiores, se analiza el flujo de uridina en función de la concentración de la misma. En el primer caso, el flujo se satura al llegar a una determinada concentración, por lo que se trata de un transportador. En el segundo caso, el flujo sigue una cinetica lineal e inferior a la anterior, por lo que se trata de difusión simple En las imágenes centrales, analizan la velocidad de entrada relativa de una concentración de glucosa 1 mM en presencia de inhibidores. En ambos casos hay una reducción de la velocidad inicial de entrada. Para observar mejor los parámetros de flujo máximo y constante de afinidad se utiliza la representación de Dixon (imagen inferior derecha). Se representan el cociente de la concentración de sustrato y flujo frente a la concentración de sustrato. La pendiente de la recta es el inverso del flujo máximo, el punto de corte con el eje Y el cociente de la constante de afinidad y el flujo máximo y el punto de corte con el eje X la constante de afinidad con signo negativo. Por último, en las dos imágenes restantes se observa lo siguiente:

129

Biofísica o

En presencia de citocalasina se observa que el comportamiento comparado en ausencia del inhibidor cambia. Las pendientes son diferentes, lo que indica que cambia el flujo máximo; pero el corte en las abscisas es el mismo, lo que indica que la constante de afinidad no varía por el inhibidor. En conclusión, la citocalasina actúa como un inhibidor no competitivo.

o

En presencia de maltosa, la pendiente es la misma que en ausencia del inhibidor por lo tanto flujo máximo no cambia. Varía el corte de ordenadas, por lo que hay un cambio en la constante de afinidad. Estas características son típicas de un inhibidor competitivo. La maltosa será captada por el mismo centro de unión que la glucosa pero con menor afinidad.

En un inhibidor acompetitivo se observa que cambian ambos parámetros en presencia del inhibidor.

Difusión facilitada: Hasta ahora hemos descritos generalidades comunes a todos los transportes que implican el uso del transportadores. Ahora describiremos las diferencias entre la difusion facilitada (sin coste energético), bien por canal (abierto simultáneamente a ambos lados) o transportador (modelo alternante, el centro de unión cada vez a un lado); y transporte activo tanto primario como secundario. Cinética: Consideramos una suspensión de células en un medio que contiene un sustrato no metabolizante, que tiene afinidad por un transportador de la membrana citoplasmática. El flujo inicial de entrada (f-d) obedecerá la cinética de Michaelis-Menten: 𝑱(𝒇−𝒅) = 𝑱 𝒎𝒂𝒙 ∙

𝑺

𝑲𝑺 +𝑺

(1)

Si el volumen del medio es suficientemente grande comparado con el volumen intracelular, la entrada de sustrato a las células no modificará de forma apreciable su [S]E. Sin embargo, la [S]I va aumentando, con lo que el flujo de entrada irá disminuyendo hasta anularse cuando las concentraciones se equilibren. Cuando no se puede medir ni...