23. Teoría quimiosmótica PDF

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Biofísica Tema 23. Teoría quimiosmótica: La interconversión de energía está basada en el primer principio de la termodinámica, mediante el cual si la energía total del universo es constante, esta ni se crea ni se destruye, sino que se transforma. En concreto, la transducción de energía más important...

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Biofísica

Tema 23. Teoría quimiosmótica: La interconversión de energía está basada en el primer principio de la termodinámica, mediante el cual si la energía total del universo es constante, esta ni se crea ni se destruye, sino que se transforma. En concreto, la transducción de energía más importante que ocurre en biología es la conversión de energía redox (energía de oxidorreducción) o energía luminosa en energía química (enlaces anhídrido fosfato-fosfato). Es decir, la energía redox o luminosa se emplea para convertir dos fosfatos en un pirofosfato (liberando una molécula de agua, de ahí que sea anhídrido), o para añadir sucesivos grupos fosfato a nucleótidos (AMP, ADP, ATP, etc.). Los seres vivos tienen diferentes mecanismos para producir energía en forma de ATP: 1. La primera de ellas (y la que menor proporción representa) es la fosforilación a nivel de sustrato: en la glicolisis anaerobia, había 2 reacciones en las cuales se sintetizaba ATP, ya que el sustrato que cedía dicho grupo fosfato tenía un mayor nivel energético que el ATP. En la reacción catalizada por la piruvato kinasa, el sustrato es el fosfoenolpiruvato (PEP), que se desfosforila a piruvato generando ATP en el proceso. El ADP es un sustrato de la piruvato kinasa, de ahí que se denomine “fosforilación a nivel de sustrato”. De igual manera ocurre en la reacción del 2,3-Bisfosfoglicerato a 3-Fosfoglicerato. En condiciones aerobias, la cantidad de ATP obtenida por fosforilaciones a nivel de sustrato representa menos del 10%, pero en condiciones anaerobias representará un porcentaje más importante. 2. La segunda (principal en condiciones aerobias y en mamíferos) es la fosforilación oxidativa. En ella, bien la energía de reacciones redox (respiración), o bien la energía de la luz (fase luminosa de la fotosíntesis) se va a emplear para sintetizar esos enlaces anhídridos. Desde hace tiempo se sabía que este proceso ocurre en sistemas membranosos (mitocondria, cloroplasto, membranas bacterianas) y que hacían falta dos tipos de componentes (cadena transportadora de electrones y ATPasa). Nos vamos a centrar en las transformaciones redox y luminosas como puente para la creación de un gradiente electroquimico de H+. Atenderemos a dos sistemas principalmente, aquel que es capaz de generar un gradiente de H+ [CTE] (tema anterior) y el que es capaz de utilizar el gradiente para sintetizar ATP [ATP sintasa](siguiente tema). Estos dos sistemas aunque sean independientes estarán acoplados: el gradiente producido por uno será utilizado por otro. Tenemos que situarnos hacia 1950 cuando ya se empezaban a conocer bastantes vías metabólicas. Las vías metabólicas, a parte de unos ciertos esfuerzos heroicos en los años 20, se descubrieron principalmente después de los años 40, debido a que las investigaciones que llevaron a la bomba atómica (entre otros) trajeron el carbono 14 a escala industrial. Este carbono radiactivo permitió marcar biomoléculas de manera que se pudieran seguir y estudiar rutas metabólicas, si bien en su momento fueron meramente efectos colaterales. En los años 50, por tanto, el campo estaba floreciendo, pero existían aún dos grandes enigmas: 1. El enigma de la herencia: base molecular de que los hijos se parecieran a los padres, pero no fueran idénticos 2. El enigma de la energía: base molecular del mecanismo que emplean las plantas para convertir energía lumínica en química. El primero de ellos, como ya sabemos, fue resuelto por Watson y Crick (en base a los trabajos de Rosalind Franklin) que postularon el modelo (no la estructura) de la hélice de DNA. El segundo fue resuelto por una persona igual de inteligente pero de menos renombre: Peter Mitchell. 72

Biofísica Peter Mitchell, en 1961, publicó en Nature un artículo en el que explica algo absolutamente revolucionario: lo que ahora denominamos teoría quimiosmótica. Los científicos, en general, son las personas menos imaginativas del mundo, y cuando se encuentran con un problema intentan aplicar la regla “más de lo mismo”, de manera que sabiendo que la fosforilación a nivel de sustrato era algo que ocurría, supusieron que el mismo mecanismo ocurría en mitocondrias. Creían, pues, que en las mitocondrias existía otro “intermediaro fosforilado” análogo al PEP en el citosol. Laboratorios de todo el mundo buscaban dicho intermediario fosforilado. Peter Mitchell, sin embargo, tuvo la idea de que el intermediario no era químico (una molécula) sino físico (un gradiente de protones). Era el gradiente electroquímico de protones, por tanto, lo que generaba la síntesis de ATP. Estamos hablando, por tanto, de que: ∆𝐺 (𝑝𝑎𝑠𝑜 𝐴 − 𝐵) = 𝑅𝑇 ln

[𝑥]𝑎 + 𝑧𝐹∆𝐸 [𝑥]𝑏

Que se asemeja al potencial electroquímico para dicha molécula.

Es decir, la teoría quimiosmótica explica la fosforilación oxidativa de esta manera: el gradiente electroquímico es un intermediario entre ambos sistemas y el responsable de la síntesis de ATP. El gradiente electroquímico tiene dos componentes: uno eléctrico (los protones están cargados positivamente y pueden crear diferencias de potencial) y uno químico (∆µ). ∆p es la fuerza protón-motriz, que se mantiene entre 170-200mV en todos los compartimentos en los que ha sido medida, pero con participación diferencial de los componentes químicos y eléctricos. Por ejemplo, en los tilacoides la fuerza protón-motriz se debe en gran medida a la diferencia de pH (componente químico), mientras que en las mitocondrias es la diferencia de potencial (componente eléctrico) la que juega un papel más importante.

Las membranas a través de las cuales se da el bombeo de protones reciben el nombre de membranas transductoras, ya que van a albergar los componentes que permiten transducir la energía redox en química. El lado N, negativo, de una membrana de este tipo corresponde con el lado de donde salen los H+; y el lado P, positivo, el lado al que llegan. Vemos por ejemplo que en la membrana de los tilacoides tenemos la orientación invertida.

Postulados: La idea de Mitchell se explica con gran sencillez: una mitocondria tiene una serie de proteínas que conforman la cadena transportadora de electrones, y Mitchell propone que dicha cadena emplea la energía redox (de los alimentos, por ejemplo) para bombear protones al exterior. Luego, hay una ATPasa (ATP sintasa) que, a favor del 73

Biofísica gradiente de protones, fabrica ATP. Es decir, la energía de los alimentos (que últimamente se convierte en coenzimas reducidos como NADH y FADH2) se oxida en la CTE, y la energía liberada se emplea para el gradiente de protones. Luego, el gradiente de protones se emplea para impulsar una bomba (ATPasa tipo O) que convierte el ADP y Pi en ATP. Estos son los fundamentos sobre los que apoyó Mitchell su teoría, si en un sistema no se cumplen, la teoría quimiosmótica no será aplicable. 1. La reacciones redox deben causar transporte de H+. 2. La ATPasa debe usar el ∆μ  H para sintetizar ATP. 3. El transporte de H+ debe causar hidrólisis de ATP y reversión de la CTE, ya que si existe un acoplamiento deberían de funcionar también al revés. 4. La membrana debe ser impermeable a los H+. 5. Los H+ deben estar deslocalizados. Esta no ha terminado de comprobarse del todo. La mayoría de los protones está en la célula unido a proteínas, o a otras moléculas, es decir, protones “sueltos” existen muy pocos. Suponiendo mitocondria esférica de una micra de diámetro cuyo pH interno es 7.4, averiguar cuántos protones hay. Pero ese es un valor máximo, porque muchos de esos protones están unidos a proteínas, no libres en disolución. El supuesto de mitchell hace referencia a los protones libres en disolución, lo que de nuevo no se ha terminado de comprobar. Para demostrar cada uno de estos postulados existe una demostración que iremos detallando.

Modelos de estudio: Realizamos un pequeño paréntesis para hablar de cuáles son las membranas transductoras de energía y cómo las utilizamos en los ensayos experimentales de la OXPHOS. 1. Por un lado, están las mitocondrias, evidentemente. Ya recordamos, sin embargo, que la mitocondria tiene una membrana externa y una interna: la membrana relevante en bioenergética, donde se hallan la CTE y la ATPasa, es la membrana interna. La cabeza de la ATPasa está en la zona interna, de manera que el lado del lumen es el lado N y el espacio intermembranal es el lado P. Por otro lado, están las SMPs: partículas submitocondriales, obtenidas tratando las mitocondrias con ultrasonidos, de manera que estas se rompen generando unas vesículas que contienen la CTE pero están dadas la vuelta (como un calcetín) de manera que la cabeza de la ATPasa está en la parte de fuera por lo que el lado N está fuera y el P dentro. Muy parecidas a las mitocondrias son las bacterias respiratorias: tienen en su membrana plasmática la CTE, la ATPasa, etc, y como las mitocondrias tienen dentro el lado N y fuera el P. Hay técnicas, a las que no entraremos en detalle, para producir vesículas con el lado N dentro o bien con el N fuera, a partir de estas bacterias. Son técnicas de laboratorio muy bien establecidas, y meramente debemos saber que son posibles. 2. En otro lugar están los cloroplastos: Mitchell, de hecho, no sólo explicó la OXPHOS en las mitocondrias sino también la fotofosforilación en cloroplastos, ya que demostró que eran dos variantes del mismo proceso. En este caso, el botón de la ATPasa está en el exterior (N en el exterior). Existe una preparación 74

Biofísica que comúnmente se llama “cloroplastos rotos” y que en la práctica son tilacoides. El counterpart bacteriano de los cloroplastos son las bacterias fotosintéticas como Rhodobacter, que también (lo mismo que las respiratorias) básicamente tienen la CTE en unas invaginaciones de la membrana y la ATPasa, como en las otras bacterias, tiene el botón en el interior (interior es el lado N). A partir de estas membranas fotosintéticas se pueden obtener vesículas invertidas, denominadas cromatóforos.´ 3. Las bacterias Gram- son difíciles de estudiar ya que su membrana externa es impermeable a muchos reactivos: ATP, ADP, NADH, etc., por lo que no son capaces de pasar la membrana citoplasmática. Por lo que se suelen utilizar vesículas creadas a partir de la membrana interna. Según el procedimiento seguido pueden obtenerse vesículas: Right-side-out o Inside-out. Esta técnica nos permite controlar los sustratos que añadamos o que produzcan, más fácilmente. El problema es que podemos perder alguna proteína soluble implicada en el transporte o en alguna interacción necesaria. 4. Halobacterias: estas bacterias, en lugar de tener CTE, tienen una proteína (la bacteriorrodopsina) que con la energía luminosa expulsa protones y, como siempre, la cabeza de la ATPasa está hacia dentro. 5. Por último, están los sistemas reconstituidos: los sistemas reconstituidos son obtenidos artificialmente por purificación de proteínas de membrana e inserción de estas en vesículas. Ahora, tendremos que comprobar experimentalmente todas las consecuencias de la teoría de Mitchell. Las reacciones redox de la CTE generan transporte de protones: Experimentos pulso O2: ¿Bombea protones la cadena transportadora de electrones? Esto se resolvió con el experimento del pulso de oxígeno. Un pulso en bioquímica es añadir una cantidad de un reactivo en un tiempo mínimo y de una sola vez. Existe un aparato muy sencillo, barato y útil que se denomina electrodo de oxígeno o electrodo de Clark. El electrodo está en la base de un recipiente de unos 3-5ml, y en el recipiente se puede meter un pHmetro o electrodo de pH, y un tapón de goma que se puede perforar con una aguja de una jeringa. La jeringa inyectará aire saturado en oxígeno a presión. Se rellena por completo el volumen con una disolución poco tamponada (queremos medir variaciones de pH), mitocondrias intactas (vesículas) y un sustrato oxidable (cualquier intermediario del ciclo de Krebs que pueda oxidarse). La muestra se mantendrá agitada por una mosca magnética. En situación de anoxia, medimos la concentración de protones en el exterior gracias al pHmetro. Tras eso, inyectamos un pulso de O2, normalmente se inyecta un volumen conocido de H2O ya que contiene oxígeno; y se mide, de nuevo, la concentración de H+ en el exterior. Vemos que tras la inyección de oxígeno la concentración de protones ha aumentado, esto se debe a que la cadena transportadora ha comenzado a funcionar ya que ahora está presente su aceptor final de electrones y por consiguiente, se irán bombeando protones. Una vez se agote el oxígeno disponible, la cadena transportadora se bloqueará y por consiguiente no aumentara la concentración de protones. La concentración de H comenzará 75

Biofísica a bajar porque volverán a la matriz de la mitocondria debido a (i) permeabilidad de la membrana interna a los protones; la bajada con poca pendiente (respecto a la subida) indica que la membrana interna es poco permeable al paso de protones. Cuando añadimos el ionóforo FCCP (es un desacoplante), la concentración de protones caerá de forma brusca. (ii) La acción endógena del antiporte de Na+/H+ y (iii) entrada de Pi electroneutro. De aquí se puede calcular los protones bombeados por ATP. También se añade valiomicina (ionóforo) y una alta concentración de KCl para intentar minimizar el cambio de voltaje creado por la salida de H: el aumento de carga positiva en el exterior influirá en el transporte de H, al añadir la valiomicina, el K entrará en la mitocondria y así descargará ∆Ψ. ¿Qué demuestra el experimento?: Que la CTE genera bombeo de protones. De manera secundaria, demuestra también que la membrana era poco permeable a los protones, ya que tardaban mucho en volver a entrar. ¿Dónde se le echaron en el cuello a Mitchell? Incluso con los pHmetros de ahora, una décima de pH hay que tomársela con cuidado, por lo que 2 centésimas, y si encima contradecía a toda la comunidad científica con una base tan endeble, le dieron por todos los lados. La ATPasa debe usar el gradiente electroquímico para sintetizar ATP: Inducción ácida: Una predicción de la teoría quimiosmótica es que, dado que el papel de la transferencia de electrones en la síntesis mitocondrial de ATP es simplemente bombear protones para crear el potencial electroquímico de la fuerza protón-motriz, un gradiente de protones creado artificialmente debería poder reemplazar la transferencia de electrones como impulsor de la síntesis de ATP. La predicción se ha confirmado experimentalmente. En este experimento en dos pasos (a) se incuban primeramente mitocondrias aisladas en un tampón a pH 9 que contiene KCl 0.1M. La lenta entrada de tampón y KCl a las mitocondrias hace que finalmente la matriz se encuentre en equilibrio con el medio circundante. No se encuentran presentes sustratos oxidables. (b) Las mitocondrias se separan ahora del tampón de pH 9 y se resuspenden en tampón de pH 7 que contiene valinomicina pero no KCl. El cambio de tampón crea una diferencia de dos unidades de pH a través de la membrana interna de las mitocondrias. El flujo de K+ hacia el exterior, llevado a cabo (por la valiomicina) a favor de su concentración de gradiente pero sin un contraion, crea un desequilibrio de carga a través de la membrana (matriz negativa). La suma del potencial químico proporcionado por la diferencia de pH y el potencial eléctrico debido a la separación de cargas constituye una fuerza protón-motriz suficientemente grande para permitir la síntesis de ATP en ausencia de sustrato oxidable. Otro experimento, llevado a cabo por Jaggerdorf en tilacoides también demuestra este postulado. Este experimento se conoce como baño ácido. 76

Biofísica Las membranas de los tilacoides se incuban en la oscuridad a un pH de 4, junto con un inhibidor de la cadena transportadora de electrones y succinato (donador de los electrones). Con el tiempo, el succinato penetra en el interior del tilacoide e induce la liberación de protones con la consiguiente bajada del pH hasta 4. Repentinamente cambiamos el pH de la disolución externa por pH 8, creando un ∆pH de 4 unidades a través de la membrana. Al añadir ADP y Pi, el flujo de protones atraviesa la ATP sintasa y permite la síntesis de ATP. Debido al cambio de voltaje creado también se producen movimiento en otros iones. Si añadimos un desacoplante como el FCCP que permite el paso de H+ fuera de la célula vemos que no se producirá ATP. Los tilacoides en ausencia de luz forman ATP, por tanto, la luz no hace falta para sintetizar ATP, sino un gradiente de protones. No siempre encontramos un acoplamiento entre la CTE y la ATP sintasa. Por ejemplo, las bacterias púrpuras que viven en medios muy salinos y no tienen oxígeno disponible no pueden utilizar la cadena transportadora y producir el suficiente gradiente electroquímico de H+ como para sintetiza ATP. Por eso, se acopla con la bacteriorrodopsina, la cual bombea protones al interior de la bacteria cuando se expone a la luz. Este gradiente será utilizado para sintetizar ATP. ¿Qué demuestra el experimento?: Esto demostró que la ATPasa bombea protones y que el bombeo de protones se emplea para síntesis de ATP, dado que este gradiente no tiene que estar obligatoriamente creado por la CTE. De hecho, en bacterias púrpuras que viven en medios muy salinos (Halobacterias) no utilizan la CTE porque no tienen oxígeno sino que acoplan el movimiento de protones a la bacteriorrodopsina que lo hace por medio de la luz, y la ATP sintasa emplea el gradiente para la síntesis de ATP. La membrana debe ser impermeable a los protones: Se demostró por qué en presencia de detergentes en concentraciones sub-solubilizantes (no solubilizan la membrana pero la hacen más permeable) o de algunos ionóforos que no había síntesis de ATP, porque el gradiente se disipaba. Acoplamiento del gradiente de protones y síntesis de ATP: Experimento de Stoeckenius y Racker: Stoeckenius trabajaba con bacteriorrodopsina en Halobacterium. Racker era el señor que descubrió la ATPasa mitocondrial, que descubrió que se inhibía por oligomicina, puso los nombres FO-F1. En una bicapa de lípidos de soja, consiguió meter por un lado ATPasa de corazón de buey y por otro lado Stoeckenius le dio bacteriorrodopsina. Había, en el exterior, ATP y Pi marcado. Encendiendo la luz, se produjo ATP. Esto fue espectacular, porque cada componente por separado no se había visto en la vida, evolutivamente completamente separadas (halobacteria, planta, mamífero), pero aun así en el momento en el que hay un gradiente de protones la ATPasa sintetiza ATP. 77

Biofísica Conllevó, además, el desarrollo de la técnica de reconstitución de proteínas de membrana. El paper ocupó sólo 2 páginas. El transporte de protones debe causar hidrólisis de ATP y reversión de la CTE (acoplamiento): También se sabía, desde hace tiempo, que existían unas sustancias denominadas “desacoplantes”. Desacoplaban la CTE y la ATPasa, de manera que en presencia de estas sustancias la cadena funcionaba de manera rápida, la ATPasa estaba perfectamente activa (hidrolizaba ATP, porque la ATPasa funciona en ambos sentidos) y sin embargo no se sintetizaba ATP, sino que se hidrolizaba, pero no era porque los componentes por separado no funcionaran. Esto parecía actuar de manera mágica, porque no se veía qué tenía en común su estructura que pudiera hacer que funcionara. Uno de ellos, por ejemplo, era el DNP (Dinitrofenol), otro es el CCCP. Funcionaban muy bien como desacoplantes, pero no sabía por qué. Mitchell se fijó en que todos ellos eran ácidos o bases débiles que tenían la carga deslocalizada. Eso hace que estos ácidos o bases débiles con la carga deslocalizada puedan atravesar la membrana. Si tengo un gradiente de protones con muchos fuera y pocos dentro, por ejemplo el DNP cargado negativamente fuera se unirá a los protones para perder la carga, y entra a la membrana, pero como dentro hay pocos protones se disocia, el DNP cargado negativamente como la carga la tiene deslocalizada vuelve a salir, repitiendo el ciclo. En el ciclo, en cada vuelta mete un protón: el DNP es desacoplante porque descarga el gradiente de protones. Los protones deben estar deslocalizados: Esto está aún sometido a debate pero parece que la caída de pH se acelera por aniones.

Acoplamiento cinético: Hemos demostrado con una serie de experimentos que el gradiente electroquímico está acoplado con la ATP sintasa para sintetizar ...