3 - Modellorganismus Xenopus PDF

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Modellorganismus: Xenopus laevis Defektexperimente   

Wilhelm Roux (1887) Wie werden Zellen verschieden? Zerstörung einer Blastomere  halbe Blastula entsteht  halber Embryo

Regulation und Totipotenz beim 4-zelligen Seeigel-Embryo  

vier verschiedene Blastomere  jeder entwickelt sich zur Blastula  jede Zelle enthält nötige Information Verlust der Totipotenz beim 8-zelligen Seeigel  verschiedene Entwicklungsschicksale

Furchung bei Xenopus     

holoblastische inäquale Radiärfurchung typisch für Amphibien meso-/telolecithale Eier (Dotter ist am vegetativen Pol angereichert) Teilung inäqual (Teilungsachse zum animalen Pol verschoben) verkürzter Zellzyklus während Furchungsteilungen: o Dauer des Zellzyklus einer normalen Körperzelle: ca. 24 h o ca. 30 min bei Xenopus o ca. 15 min bei Drosophila o keine G-Phase, nur Mitose & S-Phase  erste Zellteilungen sehr schnell o viele Replikationsstartpunkte o innerhalb von 5-6 Stunden bis zur Blastula

Anlageplan bei Xenopus

Gastrulation – Involution und Epibolie

1. 2.

3.

Die Gastrulation beginnt, wenn sich die Flaschenzellen direkt unter dem Zentrum des grauen Halbmondes nach innen bewegen, um die dorsale Lippe des zukünftigen Urmundes (Blastoporus) zu bilden. Die Zellen des animalischen Pols breiten sich aus und drängen Oberflächenzellen unter ihnen auf die dorsale Urmundlippe zu und über deren Rand. Diese Zellen gelangen so ins Innere des Embryos, wo sie Entoderm und Mesoderm bilden. Dieses Einrollen (Involution) erzeugt den Urdarm und verdrängt das Blastocoel. Die Urmundlippe bildet einen Kreis, wobei Zellen rund um den Urmund ins Innere wandern; in den Urmund ragt der Dotterpfropf. Epibolie: Ektoderm, das Embryo umschließt teilt sich schneller  Mesoderm & Entoderm werden verdrängt

Bildung der Urgewebe - Keimblätter

Verschiebung des Zytoplasmas durch Spermieneintritt     

kortikales Plasma dünnflüssiger, da kein Dotter vorhanden bei Spermieneintritt Verschiebung / Rotation des Plasmas Pigmentierung oben zum Schutz vor Sonneneinstrahlung & Fressfeinde Überlagerung der Pigmente bei Rotation  grauer Halbmond genau gegenüber der Spermieneintrittsstelle zytoplasmatische Determinanten: Chromosomen-Diminution o besonderer Effekt bei einigen Nematoden o bei Teilung entstehen 2 Blastomeren o in einer bleiben Chromosomen intakt o in anderer Verlust/Zerfall (= Diminuation) von Chromosomenstücken

Dorso-Ventral-Festlegung in der Zygote Schnürungsexperimente einer Zygote (Spemann 1922) 

nur die Hälfte mit dem grauen Halbmond bildet ganzen Embryo (Kopf, Schwanz)

 ohne Rotation, also ohne grauen Halbmond, kein Kopf und Rücken, sondern nur Bauchstücke

Zentrosomentheorie der Befruchtung (Theodor Boveri)     

Mikrotubuli lassen Zytoplasma um ca. 30° rotieren  wichtig für die Bildung des grauen Halbmondes & Corticalrotation Nachweis: Colchicin/Taxol  keine Mikrotubuli  keine Rotation  keine Rücken-/Kopfstrukturen Mikrotubuli transportieren Proteine auf die Dorsalseite  Festlegung der Kopf- und Rückenentwicklung die Rotation plus Transport bilden dorsalisierendes Zentrum (Nieuwkoop-Zentrum) Nieuwkoopzentrum enthält dorsalisierende Faktoren

Die Faktoren-Rolle von Dsh, GSK-3 und β-Catenin  β-Catenin in Oozyte zunächst gleich verteilt  GSK-3 (Glykogensynthase-Kinase 3) phosphoryliert β-Catenin  Abbau  vegetativer Pol = Inhibitor von GSK-3 (Dishevelled; Dsh)  Befruchtung  Verlagerung von Dsh in Nieuwkoopzentrum  dorsoventral (D/V)-Achse + Organisator  Rotation des Cortex transportiert Dishevelled mittels GBP („GSK-binding protein“) und Mikrotubuli  Kinesin vermittelt Interaktion mit Mikrotubuli  Reorganisation des Zytoplasmas in der Zygote  dorsal: Dishevelled inhibiert GSK-3  kein Abbau von β-Catenin  Akkumulation von β-Catenin  ventral: GSK-3 phosphoryliert β-Catenin und initiiert Abbau von β-Catenin 

Umsetzung Signal ab „Midblastula Transition“

Ventrale Seite β-Catenin wird durch GSK-3 phosphoryliert und abgebaut

Dorsale Seite Dishevelled hemmt GSK-3 Zelle überlappend mit Nieuwkoop-Zentrum

βCatenin induziert siamosis-Expression siamosis = Transkriptionsfaktor  schaltet weitere Gene an  Goosecoid

Induktion von Mesoderm durch maternale Faktoren  

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diffusible Faktoren im Embryo induzieren Mesoderm Kombinationsexperiment von Nieuwkoop (1969): Kombination zeigt, dass Faktoren aus dem vegetativen Bereich des Embryos benachbarte Zellen induzieren können Animale Cap-Zellen werden durch von vegetalen Zellen ausgeschütteten Faktoren zu Mesoderm Suche nach maternalen Faktoren im Xenopus-Ei über cDNA-Banken o 1985-1987: Arbeiten von D. Melton o Erstellung von cDNA-Banken für Gesamt-DNA, cDNA-Bank-animal und cDNA-Bank-vegetativ Suche nach Mesoderm-induzierenden Faktoren mit dem „animal cap assay“ (Animale Kappen-Experimente)

VegT o o o Vg1 o o o o

mRNA kodiert einen Transkriptionsfaktor der T-Box-Familie reguliert Genexpression in vegetativen Zellen Entfernen der VegT mRNA führt zu Embryonen ohne Mesoderm und mit wenig Entoderm mRNA kodiert einen Wachstumsfaktor der TGF-β-Familie konzentrationsabhängige Induktion von Mesoderm durch TGF-β-Wachstumsfaktoren TGF-β-Proteinfamilie (Superfamilie) z.B. TGF-β, BMPs, Aktivin (Xenopus), Vg1, Nodal-related (Xnrs), Dpp (BMP)

TGF-β-Wachstumsfaktoren induzieren Zellen über den smad-Signalweg (Rezeptor-Serin-Threonin-Kinase) BMP4 und wnt8 ventralisieren o BMP = bone morphogenic protein o wnt-Signalweg ist konservierter Signalweg von C. elegans bis zum Mensch

o

BMP4 und Xwnt werden freigesetzt durch Vg1 und VegT

Der Spemann-Organisator     

Festlegung des Entwicklungsschicksals während der Gastrulation heteroblastische Austauschtransplantation der dorsalen Urmundlippe Transplantationsversuche beim Molch (Hans Spemann + Hilde Mangold) A. Frühe Gastrula = Entwicklung ortsgemäß B. Späte Gastrula = Entwicklung herkunftsgemäß

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konservierte Struktur des Organisators Organisator wird über β-Catenin-Weg über Goosecoid zum Organisator Expression von anti-BMPs (Chordin, Noggin, Follistatin) Expression von anti-wnts (Frizbee, Dickkopf, Cerberus) Xenopus: Abfangen von ventralen Signalen  Aufbau eines BMP4 und wnt8-Gradienten Grundzustand ist dorsal konservierte regulatorische Faktoren / Schlüssel-Transkriptionsfaktoren o goosecoid (Xenopus) o bicoid (Drosophila wenn Gene des Organisators fehlen o Beispiel: Lim-1-Transkriptionsfaktor  wichtig für Organisatorfunktion in Mäusen  knock-out führt zu Mäusen ohne Kopf o Fehlen von Noggin (diffusibles anti-BMP) führt zu Ventralisierung wenn Genprodukte des Organisators zusätzlich vorhanden sind o Beispiel: diffusible anti-wnts o Cerberus induziert Kopfstrukturen o Injektion von Frzb-mRNA dorsalisiert Konservierung der Achsenbildung bei Xenopus/Drosophila o BMP4/Chordin o dpp/short gastrulation (sog)

Eigenschaften des Organisators 1. Induziert sekundäre Körperachse mit Schlund (dorsales Entoderm) 2. Induziert die Bildung von Neuralgewebe aus Ektoderm 3. Dorsalisiert umliegendes Mesoderm 4. Differenziert sich selbst zu dorsalem Mesoderm 5. Initiiert Gastrulationsbewegungen

Neuralinduktion     

Grundzustand isolierter ancap-Zellen ist neural 1. Animal cap Assay: Animal cap  Epidermis (Keratin+, NCAM-) 2. Dissoziierte animal cap-Zellen, in Kultur  neural (Keratin-, NCAM+) Gruppeneffekt dissoziierten Zellen fehlt Epidermisbildendes Signal: BMP4 o Identifizierung des Signals: Zellen dissoziiert, Faktor X dazu, Analyse epidermaler Marker o Chordin inhibiert BMP4-Rezeptorbindung und induziert so Bildung von neuralem Gewebe

Nachweis der Neuralinduktion mittels PCR...