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AMMINOACIDI Le proteine sono polimeri di amminoacidi, in cui ogni residuo amminoacidico è unito a quelli vicini mediante un legame peptidico, un particolare tipo di legame covalente. Tutti i 20 amminoacidi presenti nelle proteine sono α-amminoacidi; hanno un gruppo carbossilico e un gruppo amminico legati allo steso atomo di carbonio (Carbonio α) e differiscono per la catena laterale – gruppo R – che si differenzia per struttura, dimensioni e carica. In aggiunta a questi 20, ce ne sono altri meno comuni; alcuni di questi sono amminoacidi comuni che subiscono modificazioni dopo essere stati inseriti nelle proteine. In tutti i comuni amminoacidi, eccetto la glicina, il carbonio α è legato a quattro gruppi differenti: 1. Gruppo carbossilico COOH 2. Gruppo amminico NH3 3. Gruppo R 4. Atomo di H Il carbonio α è quindi un centro chirale. I quattro gruppi differenti possono disporsi nello spazio in due modi differenti, speculari e non sovrapponibili: per ogni amminoacido sono possibili due enantiomeri. La configurazione assoluta di zuccheri e amminoacidi semplici viene stabilita con il sistema D/L; negli amminoacidi, si usa come riferimento, anziché la gliceraldeide, l'Alanina: il gruppo COOH occupa la stessa posizione del gruppo CHO della gliceraldeide, in alto. L e D si riferiscono alla configurazione assoluta dei quattro sostituenti attorno ad un carbonio chirale, e non alle proprietà ottiche della molecola.

I residui amminoacidici nelle molecole proteiche sono tutti stereoisomeri L; gli amminoacidi della serie D sono presenti in pochi peptidi, solitamente piccoli. La formazione di strutture stabili e ripetitive come quelle delle proteine richiede di solito che i residui appartengano tutti alla stessa serie stereochimica. CLASSIFICAZIONE AM MINOACIDI È possibile raggruppare gli amminoacidi in cinque classi principali, sulla base delle proprietà dei gruppi R, utilizzando in particolare la loro polarità (capacità di interagire con H2O a pH fisiologico). I gruppi R hanno polarità molto variabile, da quelli non polari e idrofobici a quelli altamente polari e idrofilici. Glicina, istidina e cisteina sono difficilmente caratterizzabili e non si adattano bene a nessun gruppo, ma vengono comunque assegnati secondo criteri particolari. I cinque gruppi sono: 1. Gruppi R alifatici non polari 2. Gruppi R aromatici 3. Gruppi R polari, non carichi 4. Gruppi R carichi positivamente (basici) 5. Gruppi R carichi negativamente (acidi)

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1. GRUPPI R ALIFATICI NON POLARI Ala, Val, Leu, Ile, Gly, Met, Pro Gruppi non polari e quindi idrofobici. - Le catene laterali di Ala, Val, Leu e Ile tendono a raggrupparsi all'interno delle proteine, stabilizzando la struttura proteica tramite interazioni idrofobiche. La catena laterale di Ile contiene un secondo centro chirale. - La glicina ha la struttura più semplice in assoluto, e anche se si raggruppa più facilmente con gli amminoacidi non polari, la sua minuscola catena laterale (-H) non contribuisce alla formazione di interazioni idrofobiche. - La metionina, uno dei due amminoacidi solforati, ha un gruppo tioestere non polare. - La prolina ha una catena laterale alifatica, con una caratteristica struttura ciclica, in quanto si lega sia al C chiralico sia all’azoto. Il gruppo amminico secondario carico NH2+, facente parte dell'anello, è mantenuto in una conformazione rigida, che riduce la flessibilità strutturali delle regioni della proteina in cui è presente la prolina. 2. GRUPPI R AROMATICI Phe, Tyr, Trp I tre amminoacidi Phe, Tyr e Trp, con le catene laterali aromatiche, sono relativamente non polari e idrofobici. Tutti e tre possono stabilire interazioni idrofobiche. - Il gruppo OH della tirosina è altamente reattivo: può formare legami a H, ed è un gruppo funzionale importante in alcuni enzimi. - Tyr e Trp sono molto più polari di Phe, per la presenza di OH in Tyr e dell'atomo di N nell'anello di Trp. - Tyr e Trp, e in misura minore anche Phe, assorbono la luce UV a 280 nm; questo spiega il caratteristico assorbimento delle proteine, proprietà sfruttata dai ricercatori. 3. GRUPPI R POLARI, NON CARICHI Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Pro I gruppi R di questo gruppo sono molto più idrofilici di quelli degli amminoacidi non polari, poiché formano legami idrogeno con l'acqua. - La polarità della Ser e della Thr è dovuta al loro gruppo OH, mentre quella di Asn e Gln ai loro gruppi ammidici. - Asn e Gln sono ammidi di altri due amminoacidi, rispettivamente Asp e Glu, in cui le due ammidi possono essere convertite mediante idrolisi acida o basica. - La Cys è un caso particolare: polarità modesta, a cui contribuisce il suo gruppi SH (sulfidrilico). È un acido debole, per cui può formare legami H deboli con ossigeno e azoto. È facilmente ossidabile e forma, mediante un legame covalente, un dimero chiamato cistina, in cui i due monomeri sono uniti da un ponte disolfuro. In questa forma, i residui di Cys sono molto idrofobici. Ponti disolfuro sono presenti in molte proteine e ne stabilizzano la struttura, formando legami covalenti tra parti di una stessa proteina o tra due proteine diverse. 4. GRUPPI R BASICI – CARICHI POSITIVAMENTE Lys, His, Arg I gruppi R più idrofilici sono quelli che contengono cariche nette + o -. Questi amminoacidi hanno una carica netta + a pH 7.0. 2

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Lys ha un secondo gruppo amminico primario nella sua catena alifatica. Arg ha un gruppo guanidinico carico positivamente. His contiene un gruppo imidazolico aromatico. È l'unico amminoacido delle proteine ad avere una catena laterale ionizzabile con un pKa vicino alla neutralità: a pH 7.0, può essere sia carica positivamente che completamente priva di carica.

5. GRUPPI R ACIDI – CARICHI NEGATIVAMENTE Asp, Glu I due amminoacidi che hanno gruppi R carichi negativamente a pH 7.0 sono l'aspartato e il glutammato, entrambi dotati di un secondo gruppo carbossilico COO-.

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ACIDI/BASI I gruppi amminici e carbossilici degli amminoacidi, insieme ai gruppi R ionizzabili di alcuni di essi, si comportano come acidi e basi deboli. Quando un aa che non possiede un gruppo R ionizzabile viene sciolto in acqua a pH neutro, esso esiste in soluzione sotto forma di ione dipolare, detto zwitterione (COO- e NH3+), e può comportarsi sia come acido che come base; lo zwitterione ha carica netta uguale a 0. Può acquistare un H a livello del COO-, e la carica diventa +1, oppure perderne uno da NH3+ (che diventa NH2), e la carica sarà -1. I composti che hanno questa doppia natura sono detti composti anfoterici. Un semplice α-amminoacido monoammino monocarbossilico, come l'alanina, quando è completamente protonato, è un acido diprotico, in quanto possiede due gruppi funzionali che possono cedere protoni: il gruppo COOH e il gruppo NH3+ (carica netta +1). TITOLAZ IONE ACIDO-BASE La titolazione acido-base comporta la graduale aggiunta o rimozione di protoni a gruppi funzionali ionizzabili. Curva della Glicina: i due gruppi ionizzabili della glicina diprotica, ovvero COOH e NH3+, vengono titolati con una base forte, come NaOH. La curva mostra due fasi distinte, corrispondenti ai due differenti gruppi titolabili. Ciascuna fase assomiglia alla curva di un acido monoprotico, come l'acido acetico. A pH bassi prevale la forma completamente protonata NH3+-CH2COOH. 1. Nella prima fase della titolazione, il gruppo COOH perde il suo protone. Nel punto di mezzo di questa fase, si hanno delle concentrazioni equimolari delle due forme, protonata (COOH) e non protonata (COO-). Come per ogni acido debole, il punto di flesso equivale al punto di mezzo, ed equivale al pKa del gruppo che viene titolato. Per la glicina, il pH al punto di mezzo della prima fase (pK1) è 2,34. 2. Man mano che la titolazione procede, si raggiunge un altro punto importante a pH 5,97: c'è un altro punto di flesso, a cui corrisponde la rimozione quasi completa del primo protone, mentre la rimozione del secondo è appena cominciata. Questo è il punto in cui la glicina si trova nella sua forma zwitterionica, chiamato punto isoelettrico (pI). 3. La seconda fase della titolazione corrisponde alla rimozione di un protone da –NH3+. Il pH corrispondente al punto di mezzo di questa fase è 9,60, e corrisponde al pKa del gruppo amminico (pK2). 4. La titolazione è essenzialmente completa a pH 12, che corrisponde al pH al quale la forma predominante della glicina è NH2–CH2–COO-, completamente deprotonata. Quindi:  a pH acido prevale la forma diprotica, con carica netta +1;  a pH 5,97 la forma zwitterionica, con carica netta 0; pI = 5,97  a pH basico la forma completamente deprotonata, con carica netta -1.  A pH fisiologico (7,4), gli amminoacidi sono presenti per lo più in forma zwitterionica. Dalla curva di titolazione della glicina, possiamo ricavare alcune importanti informazioni:  I valori indicativi di pKa dei due gruppi ionizzabili: o pK1 = 2,34 (COOH) o pk2 = 9,60 (NH3+)

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Il pKa di un gruppo funzionale è fortemente influenzato dal suo intorno chimico. I gruppi funzionali carbossilico e amminico di un amminoacido sono più facilmente ionizzabili rispetto al loro pKa in altri composti. o Il gruppo COOH della glicina è 100 volte più acido (più facilmente ionizzabile) di quello dell'acido acetico, che ha pKa=4,76.il valore più basso del pKa della glicina è dovuto alla repulsione tra il protone uscente e la vicina carica positiva del gruppo amminico, anch'esso legato al carbonio α. Le cariche opposte sullo zwitterione risultante sono stabilizzanti. o Analogamente, il pKa del gruppo NH3+ della glicina si sposta verso valori più bassi rispetto al valore medio di un gruppo amminico. Questo effetto è dovuto in parte agli atomi di ossigeno elettronegativi dei gruppi carbossilici, che tendono ad attrarre gli elettroni e aumentano la tendenza del gruppo amminico a cedere il protone. Questo effetto viene talvolta sfruttato nei siti attivi degli enzimi, per favorire reazioni basate su meccanismi che dipendono da valori modificati dei pKa di gruppi accettori o donatori di protoni. Osservando la curva di titolazione della glicina si può dedurre che ha due regioni con potere tamponante. Una di queste corrisponde alla zona relativamente piatta della curva, intorno a pKa = 2,34. Ciò indica che la glicina è un buon tampone intorno a questo pH. L'altra zona è quella intorno a pH 9,60. NB: la glicina non è un buon tampone in corrispondenza del pH intracellulare di circa 7,4, che è compreso tra i due valori di pH in cui la glicina esercita funzione di tampone. Relazione tra la carica netta della glicina e il pH della soluzione. o A pH 5,97, il punto di flesso tra le due fasi della curva, la glicina è presente prevalentemente come forma zwitterionica, ma con carica netta pari a 0. Questo valore, caratteristico per ogni amminoacido, a cui la carica netta è pari a 0 è detto punto isoelettrico, indicato con pI. Per la glicina, che non ha gruppi ionizzabili nel gruppo R, pI è soltanto la media aritmetica dei due valori di pKa.

1 pI = ( pK 1+ pK 2) 2 pH > pI: ogni amminoacido ha carica netta negativa, e quindi in un campo elettrico migrerà verso il polo positivo. o pH < pI: ogni amminoacido ha carica netta positiva, e quindi migrerà verso il polo negativo. Più il pH di una soluzione di glicina è lontano dal suo punto isoelettrico, maggiore sarà la carica netta delle molecole di glicina. o

AMMINOACIDI ACIDO-BASE Gli aa con un solo gruppo α-amminico, un solo gruppo α-carbossilico e un gruppo R non ionizzabile hanno curve di titolazione che ricordano quelle della glicina. Questo gruppo ha valori di pKa molto simili, anche se non identici: pKa (COOH) = 1,8/2,4; pKa (NH3) = 8,8/11,0. Le differenze di questi valori riflettono la tipologia dell'intorno chimico determinato dai loro gruppi R. Gli aa con un gruppo R ionizzabile hanno curve di titolazione più complesse, con tre fasi corrispondenti alle tre possibili tappe di ionizzazione. Avremo quindi tre valori di pKa. La fase di titolazione del gruppo R si sovrappone parzialmente a quella della titolazione del gruppo COOH, a quella di NH3 o a entrambe. I punti isoelettrici di questo gruppo riflettono il tipo di gruppo R ionizzabile della molecola. Esempio: glutammato ha pI = 3,22, più basso di quello della glicina, perché ha due gruppi COOH; istidina ha pI = 7,59, poiché ha due gruppi carichi positivamente quando sono protonati. 5

L'istidina è l'unico amminoacido che, in condizioni di completa esposizione ad ambiente acquoso, ha un gruppo R con pKa = 6,0 e può comportarsi da tampone a un pH vicino alla neutralità.

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PEPTIDI I peptidi sono polimeri di amminoacidi, uniti covalentemente mediante un legame ammidico particolare, chiamato legame peptidico (C–N). Questo tipo di legame libera una molecola di H2O, a causa della perdita di un OH- dal gruppo α-carbossilico di un amminoacido e di un H+ dal gruppo α-amminico dell'altro. La formazione del legame peptidico è un esempio di reazione di condensazione. In una catena peptidica abbiamo una continua successione di NH, carbonio α e carbonio carbonilico, a formare il "core" carbonioso della proteina; a partire dal carbonio α, però, si dipartono lateralmente le catene R, che possono essere più o meno ingombranti. Gli atomi di carbonio α di aa adiacenti sono separati da tre legami covalenti, che si susseguono in questo modo: Cα–N–C–Cα. Quando il numero degli amminoacidi è relativamente piccolo, la struttura viene detta oligopeptide. Se gli amminoacidi sono invece tanti, il prodotto viene chiamato polipeptide. NB: Anche se i termini "proteina" e "polipeptide" sono spesso considerati sinonimi, i polipeptidi hanno in genere masse molecolari inferiori a 10.000, mentre quelle con pesi molecolari maggiori sono le proteine. In un peptide, il residuo amminoterminale è quello posto ad un'estremità della catena e dotato di un gruppo α-amminico libero; all'altra estremità, abbiamo invece un residuo carbossiterminale. Nel nostro organismo, gli amminoacidi sono presenti non soltanto come associati in peptidi, ma anche in forma libera. Questo perché c'è un continuo ciclo di formazione e demolizione di proteine, e ciò porta ogni cellula ad avere un pool amminoacidico costante, che viene arricchito tramite l'alimentazione e la sintesi di amminoacidi da parte della cellula. LEGAM E PEPTIDICO Con la diffrazione dei raggi X, si notò che il legame peptidico C–N è un po' più corto nei peptidi rispetto al legame C–N nelle ammine primarie, e gli atomi che fanno parte del legame sono complanari; quindi, ciascun legame peptidico ha un parziale carattere di doppio legame. Tutti i sei atomi del gruppo peptidico (Cα, C, O, N, H, Cα) giacciono sullo stesso piano, e l'atomo di ossigeno del gruppo carbonilico è in posizione trans rispetto all'atomo di H posto sull'azoto ammidico. Da queste osservazioni, si concluse che i legami N–C non possono ruotare liberamente, è un legame rigido. Invece, i legami tra Cα–N e C–Cα sono mobili e permettono libera rotazione intorno ad essi. Lo scheletro della catena polipeptidica può quindi essere considerato come una serie di piani rigidi, in cui i piani consecutivi hanno in comune un punto di rotazione in corrispondenza di Cα. NB: alcuni gruppi R di determinate grandezze, quando occupano determinate posizioni, possono talvolta impedire la rotazione intorno ai legami. ACIDO-BASE I peptidi contengono un solo gruppo α-amminico libero, e un solo gruppo α-carbossilico libero, posti alle estremità, che sono infatti dette rispettivamente N-terminale (residuo amminoterminale) e C-terminale (residuo carbossiterminale). Questi gruppi ionizzano come quelli degli amminoacidi liberi, anche se le costanti di ionizzazioni sono diverse, per l'assenza di un gruppo con carica opposta sui rispettivi carboni-α. Tutti gli altri gruppi amminici e carbossilici sono legati covalentemente, e non possono ionizzarsi. Tuttavia, i gruppi R di alcuni aa possono ionizzarsi, e quindi determinare le caratteristiche acido-base del peptide, in sinergia con il gruppo N-terminale e quello C-terminale. Ciascun peptide, come gli aa liberi, ha una curva di titolazione caratteristica e uno specifico pH isoelettrico. Queste proprietà sono usate in alcune delle tecniche più diffuse per separare peptidi e proteine. 7

Il valore di pKa di un gruppo ionizzabile può modificarsi quando l'amminoacido entra a far parte di un peptide, in quanto le sue caratteristiche di ionizzazione possono essere alterate dalla mancanza di cariche su gruppi NH3+ o COO-, dalle interazioni con altri gruppi R e da altri fattori ambientali.

DIMENSIONI I peptidi naturali hanno dimensioni che vanno da due a molte migliaia di residui. Anche i più piccoli possono avere importanti ruoli biologici. Molti peptidi di piccole dimensioni svolgono la loro funzione biologica a concentrazioni molto basse. Esempio: alcuni ormoni dei vertebrati sono piccoli polipeptidi, come ad esempio l'ossitocina, con nove residui aa, che stimola la contrazione dell'utero, o la bradichinina, 9 residui, che inibisce l'infiammazione tissutale. Alcuni veleni estremamente tossici dei funghi, come l'ammanitina, sono anch'essi piccoli peptidi. Nelle proteine, la lunghezza delle catene polipeptidiche varia considerevolmente: si va dal citocromo c (104 residui) alla titina = 27.000 residui (PM di oltre 3 milioni). La maggior parte delle catene polipeptidiche in natura contiene meno di 2000 amminoacidi. Alcune proteine sono costituite da una singola catena polipeptidica, mentre altre, chiamate proteine multisubunità, hanno due o più polipeptidi associati in modo non covalente, che possono essere identici o diversi tra loro. Se almeno due catene sono identiche, la proteina viene detta oligomerica e le unità identiche sono chiamate protomeri. L'emoglobina, ad esempio, contiene quattro subunità polipeptidiche: due α e due β identiche tra loro. All'interno della proteina, ogni subunità α è associata non covalentemente ad una subunità β; quindi, l'emoglobina può essere considerata sia un tetramero con 4 subunità, sia un dimero di protomeri α-β. COMPOSIZ IONE La composizione amminoacidica delle proteine è molto variabile. I 20 amminoacidi più comuni non sono quasi mai distribuiti in eguali proporzioni in una stessa proteina. Molte proteine, come il chimotripsinogeno e la ribonucleasi A, sono costituite soltanto da amminoacidi e nessun altro gruppo chimico; sono dette proteine semplici. Altre proteine presentano, oltre agli aa, anche gruppi chimici addizionali, associati permanentemente; esse sono chiamate proteine coniugate. La parte non amminoacidica della proteina coniugata viene chiamata gruppo prostetico. In base alla natura del loro gruppo prostetico, abbiamo le lipoproteine, le glicoproteine e le metalloproteine. Di norma, il gruppo prostetico viene aggiunto in seguito alla formazione della catena polipeptidica, e ha un ruolo determinante nella funzione biologica della proteina. CONFORMAZIONE Lo scheletro covalente di una tipica proteina contiene numerosissimi legami, intorno a molti dei quali la rotazione è libera; perciò, una proteina può assumere un numero praticamente infinito di strutture. Tuttavia, ogni proteina ha una sua specifica funzione chimica o strutturale, perciò deve avere una propria struttura tridimensionale. La disposizione spaziale degli atomi in una proteina, o di una sua porzione, è detta conformazione. Le conformazioni possibili corrispondono a tutte le strutture che la proteina può assumere senza rottura di legami covalenti. Di tutte le possibili, solo una o poche sono quelle che predominano nelle condizioni biologiche. Ci devono essere forme multiple stabili, in quanto quando le proteine legano altre molecole o catalizzano una reazione devono anche variare conformazione. Le conformazioni che la proteina assume in condizioni diverse sono in genere quelle termodinamicamente più stabili, ovvero quelle che possiedono il più basso valore di energia libera. Quando si trovano in uno dei loro stati conformazionali funzionali, le proteine sono dette native. Per la maggior parte delle proteine, solo una caratteristica struttura, o un gruppo di strutture, è strettamente correlata alla loro funzione. In molti casi, però, alcune parti di proteine sono completamente

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prive di strutture chiaramente identificabili; queste porzi...