2. Kurstag - Proteine PDF

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Zusammenfassung des 2. Kurstages, Thema: Proteine...

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Kurstag 2 PROTEINE -

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Aminosäuren o 20 proteinogene AS, o Carboxylgruppe (COOH) + Aminogruppe (NH2) + H-Atom + Rest um zentrales α-C-Atom o chiral (außer Glycin) o L-Formen bedeutsam Peptidbindung entsteht unter Wasserabspaltung zwischen Carboxyl- und Aminogruppe

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Strukturordnung von Proteinen o Primärstruktur:  AS-Abfolge (Kette) o Sekundärstruktur:  α-Helix (schraubenförmig, CO- und NH-Gruppen bilden intramolekulare WBB, 3,6 AS pro Windung – 0,54 nm)  β-Faltblatt (auch intermolekulare WBB, 2 AS – 0,7 nm)  random coil o Tertiärstruktur:  Mehrstufenprozess: 1. Faltungsnuclei 2. Subdomänen vereinigen sich zu Domänen 3. Konformationsänderungen  kovalente & nicht-kovalente WW: Disulfidbrücken (S-S), WBB, ionische WW, hydrophobe WW o Quartärstruktur:  Zusammenlagern mehrerer Untereinheiten (Tertiärstrukturen) zu größeren Funktionseinheiten thermodynamischer Endpunkt: Energieminimum

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Seitenketten (AS-Reste in Proteinen) o saure oder basische (geladene) o polare und unpolare (ungeladen) o o o

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aromatische schwefelhaltige mit Aminogruppe (Iminosäure (z.B. durch Oxidation von Prolin))

Hydratation/Hydration = Anlagerung von Wassermolekülen o an gelöste Ionen  Bildung einer Hydrathülle o an polare und neutrale Moleküle  Bildung von WBB o

an Festkörper  Bildung von Hydraten

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Aussalzen von Proteinen Hofmeister-Reihe: beschreibt die Eigenschaften eines Salzes Proteine zu fällen o chaotrope Salze halten Proteine in Lösung = Einsalzen antichaotrope Salze fällen Proteine = Aussalzen  Vergrößerung von hydrophoben Effekten und somit Förderung der Proteinaggregation Im hohen Ionenkonzentrationsbereich lassen sich Proteine schlecht fällen = Aussalzen o

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Fraktionierte Ammoniumsulfat-Fällung nicht denaturierendes Fällungsverfahren stark geladene Ammonium- und Sulfationen entziehen Proteinen Hydrathülle  es kommt zur Aggregatbildung der Proteine durch hydrophobe Wechselwirkungen Parameter: Anzahl und Position polarer und apolarer Gruppen, Größe und Molekulargewicht der Proteine, pH-Wert und Temperatur fraktioniert = verschiedene Proteine fällen bei verschiedenen Ionenkonzentrationen aus bei 50-70% Sättigung der größte Niederschlag vollständige Fällung dauert allerdings ein paar Stunden, da die Enzyme Ca2+ benötigen und CaSO4 praktisch unlöslich Nachweis von Enzymaktivitäten Katalase spaltet Wasserstoffperoxid in Sauerstoff und Wasser Vorhandensein des Enzyms zeigt sich durch Aufschäumen = Sauerstoffentwicklung Höhe der Schaumsäule = Aktivität des Enzyms Peroxidase reduziert Wasserstoffperoxid in Gegenwart eines Elektronendonators, der Elektronendonator wird oxidiert z.B. Brenzkatechin wird oxidiert und zeigt eine rote-bräunliche Färbung, welche im Photometer gemessen werden kann

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Phosphatase – spaltet Phosphatgruppen ab z.B. bei p-Nitrophenylphosphat – wird durch abspalten der Phosphatgruppe zu p-Nitrophenol dieses weist im alkalischen eine charakteristische Gelbfärbung auf und kann im Photometer gemessen werden

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Ionenaustauschchromatographie von Proteinen Schritt 1: Bindung → Anionentauscher trägt positive Ladungen, Anion (Protein mit negativen Ladungen) Schritt 2: Elution → Ionen binden an Proteinoberfläche und „tauschen“ die Ladung Grundsätzliche Betrachtung zur Proteinreinigung: o bester Organismus und geeignetster Wachstumszustand zu wählen o Verdünnende Fraktionierungsschritte sollen sich mit konzentrierenden Fraktionierungsschritten ablösen. Die Anzahl der Gesamtschritte sollte minimal sein o Reinigungserfolg eines Enzyms muss anhand der spezifischen Aktivität und der elektrophoretischen Komplexität verfolgt werden

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Leserichtung: 5' (Aminoterminus) → 3' (Carboxyterminus) Sekundärstrukturbrecher = Prolin (da heterogener Ring) typischerweise tragen Tertiärstrukturen Co-Faktoren Co-Enzyme sind nicht fest am Enzym gebunden Chaperone = Faltungshelfer Hitzeschockproteine schützen vor Denaturierung nicht jedes Protein hat eine Quartärstruktur isoelektrischer Punkt: Nettoladung eines Proteins = 0 Alkalisieren führt zur Deprotonierung → Protein hat mehr negative Ladungen Histidin – pH-Sensor in Zelle Hydroxy-Gruppen der AS spielen Rolle bei Regulation

Mögliche Klausurfragen: -

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Nennen Sie die übergeordneten Funktionen von Proteinen: o Stoffwechsel o Signaltransduktion o Struktur o Bewegung Nennen Sie die Tertiärstruktur stabilisierende Kräfte (von stark zu schwach) o kovalente Bindungen (Disulfidbrücken) o Ionenbindungen (Salzbrücken, Peptidbindungen) o o

Wasserstoffbrücken Van-der-Waals-Kräfte...