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descrizione delle proteine fibrose in biochimica...

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Proteine fibrose e globulari GLOBULARI 1. Struttura compatta e “globulare” 2. Solubile in acqua; 3. Mix di strutture 2° tra cui α eliche, loop, β foglietti; 4. Struttura quaternaria è stabilizzata da forze non covalenti; 5. Pleiotropia funzionale (funzioni in tutti gli aspetti del metabolismo)

FIBROSE Struttura estesa; Insolubile in acqua; Struttura 2° di una sola tipologia, cioè o α elica o β foglietto; Struttura quaternaria è stabilizzata da forze di interazione covalenti; Funzione prettamente strutturale e di resistenza

Proteine fibrose. Le proteine fibrose sono polipeptidi a struttura tridimensionale caratterizzate da un alto contenuto o di sole α elica o di β foglietto. Si tratta di proteine a funzione strutturale (sia nella cellula, che nei tessuti dell’organismo come organi, pelle e capelli) e insolubili in acqua ma solubili nel doppio strato fosfolipidico. Sono proteine con funzione di resistenza e trazione nei confronti di forze meccaniche e ciò è dovuto alla presenza di legami covalenti intermolecolari. Si tratta di polimeri la cui struttura si estende secondo un unico asse, per cui esse si definiscono proteine filamentose. Esempio: -

Fibroina; Cheratina; Collagene; Elastina;

Fibroina. E’ formata esclusivamente da foglietti β. Sono le proteine della seta, in quanto sono prodotte dal baco della seta. La formazione di tessuti resistenti deriva dal contenuto informazionale che è presente nella struttura primaria: i residui amminoacidici ci indirizzano verso la formazione di una proteina fibrosa. Il contenuto in residui amminoacidici è pari a: -

45% di glicina (ha un R=H non ingombrante dal punto di vista sterico e per questo permette un migliore inserimento e compattamento tra le catene dei foglietti); 13% di serina (il gruppo R=OH permette la formazione di legami H) 29& di alanina (R=CH3 permette interazioni di Van Der Waals);

Tali amminoacidi si ripetono con motivo di 6 amminoacidi [Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala] per 600 volte fino ad ottenere una struttura di 1200 amminoacidi. Si ha una formazione di catene polipeptidiche in β-foglietto antiparallelo. L’elevata presenza di Gly permette di formare dei β-foglietto molto compatto che da’ rigidità minimizzando l’ingombro sterico; mentre ulteriore resistenza la dà la formazione di legami H e forze di Van Der Waals. La Gly ha direzione C-terminale e N-terminale opposta rispetto alla Ser e alla Ala, contribuendo a creare una struttura ad incastro tra i vari foglietti simili a quelli di una cerniera lampo. Cheratina. Dal greco “keratòs” = “corno”, tale proteina è presente nei tessuti quali capelli, unghie, strato esterno della pelle e costituisce l’intero peso secco di tali materiali. Questo tipo di proteina è costituita esclusivamente da αeliche. In particolare, la struttura 2° è costituita da un dimero di α-eliche, una sinistrorsa e l’altra destrorsa che si avvolgono l’una intorno all’altra a costituire il “coiled coil” (avvolgimento avvolto) a dare un andamento risultante

complessivo sinistrorso. Questo è ciò che avviene nella α-cheratina dei mammiferi, mentre nei pesci e rettili la cheratina assume la struttura più simile ad una fibroina che per questo viene chiamata β-cheratina. La α-cheratina possiede un alto numero di residui amminoacidi idrofobici tra cui leucine, alanine, isoleucine, valine e fenilalaline, oltre ad un altissimo contenuto in S che viene dato dalla presenza di residui polari di Cys. Le catene idrofobiche sono esposte verso l’esterno a dare interazioni di tipo idrofobico, mentre le Cys sono solitamente esposte verso l’interno e sono implicate nella formazione di ponti S-S a dare stabilità alle cheratine. Il dimero di cheratina può essere descritto in due porzioni: abbiamo la porzione globulare e una porzione filamentosa. I due monomeri si accoppiano parallelamente e formano un dimero in cui distinguiamo due teste globulari che corrispondono rispettivamente alle porzioni N-terminali e C-terminali dei tali polipeptidi avvolti. Le teste corrispondono alla porzione idrofilica della cheratina. Gerarchia della cheratina. I due monomeri di alfa eliche si accoppiano insieme a formare un dimero avente due teste nella porzione C-terminale e N-terminale. Più dimeri insieme formano protofilamenti in cui ogni testa interagisce con la testa polare del “coiled coil” a seguire e così via. Due protofilamenti formano una protofibrilla; più protofilamenti (4) formano microfibrille e infine, più microfibrille costituiscono la macrofibrilla. L’interazione testacoda avviene ad una distanza di circa 25 nm.

Analizzando il suo profilo ai raggi X notiamo che l’andamento ricorda quello di un’alfa elica ma il suo passo d’elica è pari a 5.1 A anziché 5.4 A perché l’avvolgimento avviene fra due eliche (l’elica intorno al quale si avvolge l’altra sottrae spazio). La conformazione ad “avvolgimento avvolto” è dato dall’informazione contenuta nella struttura primaria: la parte centrale della catena polipeptidica è composta da pseudo-ripetizioni di 7 residui che chiamiamo in ordine alfabetico a-b-c-d-e-f-g in cui i residui non polari prevalgono in corrispondenza delle posizioni a e d in quanto a tali posizioni corrispondono al punto in cui si avvia un nuovo passo d’elica e quindi si allungano lungo il lato e verso l’esterno all’alfa elica. Ogni giro d’elica contiene 3,6 residui amminoacidici. La struttura di ordine superiore della cheratina non è del tutto nota; sappiamo che l’alfa cheratina è ricca di residui di Cys che formano ponti disolfuro che permettono di legare catene polipeptidiche adiacenti. Le cheratine α sono classificabili anche in “dure” o “morbide” a seconda del contenuto di ponti S-S presenti e di conseguenza di Cys. Tali ponti S – S possono essere scissi attraverso l’utilizzo di riducenti come mercaptani.

I capelli trattati con tale principio subiscono un processo di permanente in cui un agente riducente mercaptanico con gruppo SH, ha azione riducente sul S—S rompendo i ponti disolfuro. Si fa assumere la forma desiderata alla fibra di capello (liscio o riccio) e si tratta nuovamente con un agente ossidante che forma nuovi ponti solfuro in un punto diverso da quello iniziale. Uno dei principali agenti riducenti con gruppo tiolo è il tioglicolato di ammonio (acido tioglicolico) che ha formula HSCH2COONH4. L’ossidazione avviene invece per utilizzo di acqua ossigenata. Lo ione tioglicolato HSCH2COO– reagisce secondo tale reazione:

La posizione dei ponti S — S determina la diversa conformazione del capello, cioè determina se il capello è liscio o riccio, inoltre tale conformazione può essere temporaneamente modificata attraverso l’utilizzo di alte temperature che scindono i legami idrofobici. Collageno. O collagene, è la principale proteina del tessuto connettivo degli animali ed è presente in pelle, tendini, capelli, cartilagine, scheletro osseo, denti e vasi sanguigni. La presenza in molteplici tessuti rende il collagene la proteina più abbondante nei mammiferi, rappresentando nell’uomo circa il 60% del peso corporeo e costituendo quasi il 50% delle proteine nei vertebrati. E’ una proteina fibrosa con elevata resistenza alla trazione ed è caratterizzata da una elevato contenuto di glicina e dalla presenza di amminoacidi rari come idrossilisina e idrossiprolina (composizione amminoacidica inusuale). Una molecola di collagene è costituita da una tripla elica rigida di 3 catene polipeptidiche avvolte fra loro con andamento sinistrorso ognuna a dare un andamento complessivo DESTRORSO (struttura quaternaria). La composizione è costituita da:

-

1/3 di Gly; 15-30% di Pro;

-

4-idrossiprolina; 3-idrossiprolina; 5-idrossilisina;

a.a. piccoli e idrofobici, glicina e prolina sono incompatibili con la alfa-elica e sono interruttori di catena, ma in questo caso sono presenti per il motivo che verrà spiegato in seguito a.a. sottoposti a modifiche post-traduzionali (aggiunta di OH) posizionati verso l’esterno dell’elica

Riconosciamo una sequenza ripetuta di 3 amminoacidi che schematizziamo come Gly – X – Y dove X è corrispondente ad un residuo di Pro e Y è corrispondente ad un residuo di idrossiPro o Ala.

Il passo dell’elica di una molecola di collagene è 2.9 A formato da 3.3 residui amminoacidi per ogni giro. La presenza della Gly (piccola) permette l’inserimento in uno spazio ridotto come quello che si trova nell’interno tra le 3 eliche, mentre le catene R voluminose di Pro e Lys sono rivolte verso l’esterno.

L’orientamento è in tale conformazione perché la Gly, avendo un R a minore ingombro sterico, può inserirsi meglio all’interno della tripla elica e contribuisce a formare legami H tra il gruppo NH della glicina stessa e il gruppo C=O della Pro, presente nella catena adiacente, in quanto le catene adiacenti hanno andamento opposto, cioè ad una Gly corrisponde una Pro. La Gly quindi è il punto di contatto tra le eliche: garantisce la formazione di legami H tra NH- e CO- del legame peptidico tra catene adiacenti. A tali punti di giuntura si aggiunge anche la presenza di residui di Pro e idrossiprolina stabilizza la TRIPLA elica (NB*) in quanto si tratta di residui rigidi che hanno valori fissi e limitati degli angoli diedrici φ e ψ e per questo “bloccano” l’impalcatura.

NB*: la stabilizzazione della tripla elica tramite Pro e hyPro è permessa in quanto si parla di legami intercatena tra più eliche sinistrorse e non legami intracatena di una singola alfa elica che è per altro destrorsa. Nel secondo caso, come abbiamo visto, parliamo di interruttori di catena. Sintesi del collagene. E’ una proteina extracellulare, che fuoriesce dalla cellula dopo il processamento della maturazione del collagene. Ogni fibra di collagene è costituita da più fibrille e ogni fibrilla è caratterizzata da un andamento sfalsato e regolare di molecole di tropocollagene che costituiscono la fibrilla. Una molecola di tropocollagene è lunga 300 nm e tra la fine di una e l’inizio di una seconda c’è una spaziatura di 40 nm. Tale spazio viene definito “hole region” ed è non completamente vuoto in quanto è ospite di numerose modifiche post-traduzionali tra cui la glicosilazione → aggiunta di residui glicosidici sui residui idrossilati della Lys. La presenza di zuccheri richiama acqua e aumenta la solubilità della molecola rendendola anche più idrofila: in questo caso il richiamo di acqua serve ad aumentare la flessibilità/lubrificazione e l’idratazione delle zone ad alto contenuto di collagene per permettere i movimenti delle giunture cellulari e non solo → difetto nella glicosilazione = ARTRITE. Gli hole regions sono anche zone che corrispondono a siti di nucleazione ossea per la formazione dello scheletro in quanto si ha l’inserzione dei cristalli proprio in tali aree.

Sintesi dal procollageno alla fibra: -

-

ambiente intracellulare: si parte dal singolo filamento (1000 a.a.) che assume la struttura secondaria di alfaelica sinistrorsa. Le eliche sinistrorse si associano poi a 3 ciascuno a costituire la struttura quaternaria con il nome di “procollageno” in cui alle estremità sono presenti amminoacidi in eccesso che saranno poi rimossi da una tipologia di peptidasi, le “procollagene peptidasi” che processano quindi la struttura verso la forma matura del collagene → Tropocollagene. Tutto questo meccanismo viene svolto all’interno delle vescicole e dell’apparato del Golgi. La rimozione di tali amminoacidi corrisponde al signaling di passaggio dall’ambiente intracellulare a quello extracellulare per mezzo di vescicole secretorie. E’ importante specificare anche che, durante i processi intracellulari, avvengono anche le modificazioni posttraduzionali che coinvolgono la Lys nella sua idrossilazione ad 5-idrossiLys e 3/4-idrossiPro e la glicosidazione delle Lys. Ambiente extracellulare: tropocollageno → Fibrilla → fibra

Importanza della vitamina C.

La vitamina C o meglio, l’acido ascorbico, è fondamentale nel processo di idrossilazione delle proline e delle lisine. L’ascorbato non è un cofattore di tale reazione in quanto non è fondamentale per espletare la funzione enzimatica, ma serve a riportare il Fe non eme dell’anello porfirinico allo stato +2 di ossidazione che altro non è che il gruppo prostetico della protein-idrossilasi di cui lisil-idrossilasi e prolil-idrossilasi → nel corso della reazione infatti l’atomo di Fe si ossida da +2 a +3 e rende l’enzima inattivo; il ripristino dell’attività viene effettuato proprio dall’ascorbato

che promuove la riduzione del Fe. Nella normale reazione di ossidrilazione del residuo di prolil 4-idrossilasi e lisil idrossilasi, una molecola di chetoglutarato e O2 si legano all’enzima: ilchetoglutarato subisce la decarbossilazione ossidativa formando CO2 e succinato, mentre l’O2 viene usato per l’ossidrilazione del residuo Prolinico o Lisinico. La prolil-4-idrossilasi catalizza anche la

La fibra del collageno subisce una ulteriore forma di stabilizzazione grazie all’enzima lisil-ossidasi che ha la funzione di ossidare il gruppo amminico della catena R della lisina in un gruppo aldeidico a formare un amminoacido modificato chiamato “allisina” che ha il compito di formare dei legami ponte tra le fibre di tropocollageno di tipo covalente detti cross-linking.

Tale formazione di cross-linking avviene per condensazione aldolica in cui l’allisina formilata si trova in equilibrio con la forma enolica. La forma aldeidica subisce attacco nucleofilo sul Cε formando un ponte di doppio legame.

Principali gruppi di collagene. Nell’uomo ci sono all’incirca 19 collageni diversi suddivisi in 4 gruppi fondamentali in base alla % di glicosilazione. Tipo I Tipo II Tipo III

Tipo IV

Presente nei legamenti, nei tendini (20% di glicosilazione) Alto grado di glicosilazione perché costituisce arterie, intestino, utero e tessuti sottoposti a continua pressione e contrazione High carbohydrate, >40% hydroxylysines → presente nella lamina basale su cui poggiano le cellule che formano organi e tessuti. Sono fortemente glicosilate per la lubrificazione che richiedono i movimenti cellulari.

Curva di denaturazione termica. Nei normali collageni la temperatura di fusione Tm (che corrisponde al valore in cui il collageno è degradato al 50%) è strettamente correlata alla temperatura corporea degli organismi e in questo caso, nei mammiferi il valore di Tm corrisponde a circa 40°C. Per questo motivo, tale valore è estremamente sensibile alle variazioni di temperatura e poiché la stabilità della tripla elica è dovuta alla presenza di residui idrossilati e legami H, la Tm si abbassa fino a 20°C qualora ci sia carenza di acido ascorbico che impedisce la riossidazione del Fe e l’attivazione di un nuovo ciclo enzimatico delle protein-idrossilasi.

l Disordine della deposizione del collagene. → Diverse patologie: -

Ehlers-Danlos syndrome: ipermobilità delle articolazioni e iperelasticità della pelle; Osteogenesi Imperfetta: formazione anormale (fragile) del tessuto osseo dei bambini; Marfan syndrome: sottogruppo dell’E-D syndrome.

Elastina. L’elastina è una proteina costituente il tessuto connettivo. Essa ha come caratteristica fondamentale quella di essere elastica, cioè di essere allungata e sottoposta a trazione, stiramento e contrazione e poi avere la capacità di tornare allo stato originario dopo essere stata sottoposta a tali stress. E’ il costituente principale della pelle, ma è presente per la sua elasticità anche in vasi polmoni e legamenti. E’ una proteina fibrosa simile al collageno per quanto riguarda la componente amminoacidica ma non per la struttura: la sua unità funzionale ha il nome di “tropoelastina” e consiste in segmenti di eliche non alfa ricche in glicina e separate da corte regioni di Ala e Lys. Poiché all’interno dell’elastina abbiamo un alto contenuto di amminoacidi idrofobici, essi impediscono al collagene di assumere una struttura ordinata secondaria e terziaria bene definita. Similmente al collagene, essa possiede un alto contenuto di Lys che introducono legami di cross-linking covalenti: tali Lys tra le unità di tropoelastina contribuiscono a collegare le subunità e a dare una conformazione iniziale stabile quando è a riposo. → 4 Lys di 4 subunità di tropoelastine reagiscono insieme a formare una molecola di desmosina. La desmosina in particolare si forma a partire da 3 Lys ossidate ad allisine (Lisil-ossidasi) e una normale. I cross-link sono responsabili della elasticità e della insolubilità. Un difetto nella formazione di tali legami e quindi nell’espressione corretta dell’elastina porta a problemi tra cui enfisema polmonare, in quanto l’elastina è un’alta componente dei tessuti elastici degli alveoli polmonari.

L’elastina ha quindi una elevata concentrazione di Gly, Pro, (no HyPro) ma diversamente dal collageno, essa ha un elevato contenuto % di Ala e Val (idrofobici) che determinano la formazione di turns-region che uniscono le strutture secondarie a dargli una organizzazione a zig-zag simile al beta-foglietto....