3. Vacas transgénicas albúmina PDF

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Profesor: Juanjo...

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EXPOSICIÓN BIOTECNOLOGÍA ANIMAL Production of recombinant albumin by a herd of cloned transgenic cattle. 1. Introducción: La albúmina es la proteína más abundante del plasma sanguíneo (54,3% de la proteína plasmática total) y una de las más abundantes en todo el cuerpo humano. Se sintetiza en el hígado y su principal función es el transporte de hormonas y fármacos por la sangre, y además participa en el mantenimiento de la presión oncótica, que permite una entrada de líquido constante en los vasos sanguíneos gracias a la diferencia en la concentración de proteínas entre el fluido sanguíneo y el intersticial. Se comenzó a utilizarse terapéuticamente en la Segund Guerra Mundial (importancia de las transfusiones de sangre) y siempre se ha extraído mediante sistemas de fraccionamiento del plasma con alcohol etílico. Inconvenientes de la obtención clásica de hSA por fraccionamiento: - Se obtiene muy poca cantidad para la demanda farmacéutica que podría tener. - Es necesario obtenerla de sangre humana obtenida mediante donaciones. - Su uso terapeútico se da en grandes cantidades por cada dosis recomendada, por lo que interesa un sistema de producción importante. - Es vital una correcta purificación de esta proteína para evitar contaminaciones víricas o priónicas con el fin de evadir la respuesta inmune frente a estos. Alternativas biotecnológicas que puedan suplir y compensar todos los problemas que el anterior sistema de obtención de hSA presenta: Utilización de animales transgénicos como BIOFACTORIAS, que pueden producir masivamente cierto producto, en este caso, se crean vacas transgénicas que expresan importantes cantidades de albúmina humana en la leche (promotor específico de expresión del producto génico en las glándulas mamarias en este caso). Antes de modificar genéticamente a animales superiores como las vacas ya se obtuvieron microorganismos transgénicos que expresan esta proteína humana, como son Saccharomyces cerevisiae (Recombumin ™) y Pichia Pastoris (Albree ™), levaduras capaces de producir albúmina humana aunque el coste y su rendimiento en producción a gran escala son importantes problemas aún (no es muy rentable). 2. Metodología para generar vacas transgénicas productoras de albúmina humana. a. Creación de un constructo que funcione (probándolo en ratones (también se puede hacer simplemente con cultivos de las células, aunque no utilizan este método porque dicen que el otro es más predictivo) y viendo qué elementos se le pueden añadir o quitar con el fin de que su expresión sea la mejor y la más óptima). Estos constructos fueron microinyectados en ratones (mediante microinyección pronuclear). 1º pBC74: resultados pobres parece ser por los efectos de posición de la integración cromosómica (zonas de la cromatina donde los fenómenos transcriptivos son escasos) 2º pBC414 añadimos un insulator en 5’ y una secuencia de poliadenilación en 3’ y si funcionó bien en 6 de 7 líneas de ratones transgénicos. 3º pBC596 al añadir un marcador de resistencia a neomicina, su proximidad con el gen de la albúmina pareció reducir la tasa de transcripción y por tanto el número de líneas transgénicas con niveles de expresión mayores a 1mg rhA/mL. 4º pBC664 incluyendo insulators que aislaran transcripcionalmente al marcador de resistencia de neomicina el número de líneas transgénicas con alta expresión aumentó por lo que finalmente eligieron este constructo para la transfección de células bovinas.

¿Por qué se realiza un análisis previo de expresión en otro organismo como es el ratón? Es importante y se realiza con muchísima frecuencia en técnicas de transferencia nuclear. Nos sirve como modelo previo de la expresión de nuestro cassette en un organismo eucariota mamífero, de crecimiento rápido y de bajo costo que nos permite predecir el comportamiento que tendrá la inserción de nuestro constructo en organismos más complejos posteriormente. b. Transferencia nuclear celular i. Desarrollo teórico de la técnica (es lo que hemos visto en teoría) ii. Cómo se llevó a cabo en este estudio: Primero se realizó una transfección con nuestro constructo pBC664 a fibroblastos bovinos y luego se seleccionaron los neomicina-resistentes (34) comprobando mediante un Southern Blot. Tras ello se eligieron 4 líneas celulares (53, 57, 59 y 60, todas) y con ellas se realizó la transferencia nuclear: 19150 intentos que resultó en la generación de 786 blastocistos y sólo 546 embriones viables (todos femeninos= producción de leche) fueron transferidos a 257 madres receptoras (2,2 embriones por receptora) que dieron lugar a sólo 20 terneros que pudieron crecer sanos hasta su etapa adulta. Mencionar un poco la eficacia del proceso. ¿Cómo hicieron para que todos los embriones fueran femeninos? Todos los fibroblastos donadores del núcleo eran hembras para evitar free martinismo (enfermedad bovina de químeras XX/XY). c. Finalmente obtención de terneros transgénicos= 20 terneros que sobrevivieron y crecieron sanos. Comprobación y análisis de los resultados obtenidos. d. Genotipado por PCR, Southern Blotting y FISH. De los 27 terneros nacidos vivos, sólo 23 eran transgénicos. ¿Qué explicación tiene esto? Inestabilidad del constructo en las sucesivas divisiones durante el desarrollo que provoca que se llegue a perder. La línea 53 presentó algunas anormalidades: sólo dos de los 6 terneros nacidos eran transgénicos y estos dos presentaban un número de copias de nuestro cassette muy alto, lo que deriva en una elevada producción de albúmina en la leche y una periodo mucho más corto de lactancia con respecto a las otras vacas transgénicas. PCR: primers específicos para rhA y para el marcador de neomicina. Southern Blot: sondas específicas para rhA. FISH: sondas específicas fluorescentes del gen que permite visualizar los cromosomas en estado metafásico y concretamente en qué cromosoma se ha integrado nuestro transgen. En las líneas 57,59 y 60 se puede apreciar que existe una simple y única integración, en cambio en el 53 la señal fluorescente es muy mayor (alto número de copia). e. Análisis de la expresión de la albúmina recombinante (rhA) mediante Western Blot y también RID Assay. Western Blot: purificando las proteínas de la leche, corriéndolas en un gel SDS-PAGE (NuPAGE), las transferimos a membrana y incubamos con un anticuerpo anti-hsA. Con esto sólo podemos ver si nuestra proteína está presente o no en la leche de la ternera. f.

Caracterización de la rhA producida (secuenciación). Análisis de estructura primaria (edman degradation and peptide mapping del extremo N-terminal de la proteína que permite secuenciar la proteína comparando con dos albúminas

comerciales), secundaria/terciaria (espectroscopia de dicroísmo circular que consiste en tratar la muestra con UV para posteriormente analizar los porcentajes de estructura secundaria existentes en la proteína y ver si si está correctamente plegada) y nativa (interacción con la bilirrubina para ver si su afinidad es similar a la “normal” extraída del suero) 3. Conclusiones a. Eficacia del proceso (0,1% de eficiencia), pero 0,01% la técnica de microinjección pronuclear. La eficacia es tan baja debido a que se da una mala reprogramación genética (los genes implicados en la reprogramación no se expresan bien) b. Posibles ventajas o inconvenientes que pueden tener este tipo de ganado transgénico. Se pueden generar un gran número de clones (mucho ganado) aunque no existe variabilidad genética entre estos (una infección podría afectar a todos por igual y que ninguno sobreviviese). Se puede utilizar este tipo de métodos para producir productos lácteos ricas en determinados nutrientes que sean deficientes en ciertas poblaciones, terapéuticos, etc. No tiene por qué utilizarse este tipo de animales sólo para biofactorías de producción para luego purificar el producto recombinante. Parte de la Transferencia Nuclear Ampliación (todo más detallado y explicado) Para generar las vacas transgénicas nos basamos en un método descubierto hace 20 años cuando consiguieron clonar a la oveja Dolly, y tal método se denomina Transferencia Nuclear de Células Somáticas (SCNT). Como ya hemos explicado en clase, partimos de células somáticas que ya se encuentran diferenciadas, en este caso se utilizan los fibroblastos porque se obtienen y se cultivan fácilmente. Entonces realizamos la electroporación, utilizando el vector que contiene el constructo, para la transformación de tales fibroblastos y seleccionamos los fibroblastos transformantes con cultivos en presencia de antibiótico (neomicina) donde los transformantes han incorporado la resistencia a tal antibiótico y sobrevivirán. A continuación, se cultivan los fibroblastos transformantes en limitación de nutrientes (“muertos de hambre”) para que se induzca su entrada en la fase G0 (estado metabólicamente inactivo) y en ese momento se fusionan (pulso eléctrico) con los ovocitos enucleados (se eliminan el pronúcleo y el cuerpo polar) para que se reprogramen las marcas epigenéticas embrionarias en la cromatina de los fibroblastos. Por último, se lleva a cabo el desarrollo in vitro de los embriones transgénicos hasta el estado de blástula y se implantan en el útero de las vacas receptoras para que continúen su desarrollo y se obtengan las crías por cesárea. Destacamos que todos los fibroblastos utilizados provienen de vacas (organismo hembra) porque queremos que todos los embriones sean vacas que se encargan de la producción de la leche donde se encuentra la albúmina humana recombinante.

Una vemos tenemos los descendientes transgénicos utilizando el método previamente explicado en las vacas, podemos analizar una tabla donde se aprecian los resultados experimentales en cuatro líneas celulares a lo largo del proceso y que nos lanza dos preguntas: 1. ¿Cuál es el “cuello de botella” de este proceso? La formación de los blastocistos tiene un porcentaje de eficacia muy bajo (4%) porque muchos genes implicados en la reprogramación no se expresan bien (mala reprogramación). Por lo tanto se trata de un paso crítico en el proceso de transferencia nuclear. 2. ¿Cuál es la eficiencia de la transferencia nuclear? Como podemos ver en la última columna de la tabla (en la fila “Totals”), el porcentaje de eficiencia es 0,1% (1 cría transgénica en 1000 intentos -> 1/1000) y, aunque el porcentaje sigue siendo bajo, es 10 veces mayor que en la inyección de pronúcleos. Y nada, destacar que se insertan aproximadamente dos embriones en cada vaca receptora. Para comprobar que nuestro transgén se encuentra en el genoma vacuno realizamos un Southern Blot utilizando ADNc de la secuencia de la albúmina humana como sonda fluorescente y vemos que sí está en su genoma. Para comprobar dónde se ha integrado nuestro transgén, realizamos una hibridación fluorescente in situ (FISH) con los cromosomas vacunos en metafase y utilizando la misma sonda que en el Southern Blot. Vemos que las integraciones simples se dan en distintos cromosomas (1, 2, 11 o desconocido) en función de las líneas celulares estudiadas porque se producen recombinaciones no homólogas en puntos calientes de recombinación. Además, sorprendentemente, comprobamos que la línea 53 tiene algunos supuestos transformantes negativos, pero los transformantes positivos producen la proteína recombinante en concentraciones 40 veces superiores a las demás líneas porque tienen numerosas integraciones en tándem (unas 300) que se aprecian en la figura A como una fluorescencia difusa....