4. Benzer E LA Struttura FINE DEL GENE PDF

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BENZER E LA STRUTTURA FINE DEL GENE Riprendiamo alcuni concetti:  Prima di Benzer si pensava che il gene fosse un’unità indivisibile e che la ricombinazione avvenisse solo fra geni diversi. Attraverso gli esperimenti di Oliver in primis e di Yanofsky si è dimostrato che ciò non è vero e la ricombinazione intragenica è possibile e l’unità più piccola di ricombinazione sono due coppie nucleotidiche.  Il test di complementazione si avvale dell’utilizzo di doppi eterozigoti in trans cioè sono eterozigoti per due geni che presentano mutazione ( m1 m2+/m1+ m2) e le due mutazioni sono disposte in trans. Questi eterozigoti doppi in trans negli eucarioti sono prodotti incrociando omozigoti per le due mutazioni in analisi cioè: (P) AAbb x aaBB sono omozigoti per le due mutazioni a e b (F1) AaBb e le mutazioni (a e b ) sono disposte in trans A b /a B Nei virus, come il fago T4, i doppi eterozigoti in trans si hanno con coinfezione di un ceppo di E.coli ad esempio di T4 mutanti per due mutazioni diverse rIIA e rIIB sono due mutanti di rII+ che infettano insieme E.coli  Il fago T4 ha un ciclo litico cioè uccide la cellula ospite. Benzer si chiese due cose: a) La mutazione coinvolge il gene in toto oppure può avvenire mutazione negli elementi che compongono il gene? b) La ricombinazione avviene solo tra geni diversi oppure può avvenire tra le componenti dello stesso gene? Per rispondere a tale domanda, utilizzo come organismo modello il fago T4 perché è facile da allevare e fa una progenie numerosa in modo tale da evidenziare gli eventi di ricombinazione rari come la ricombinazione intragenica. Del fago T4 studiò il locus rII che determina la capacità del fago di infettare una cellula ospite e come la infetta cioè influenza due fenotipi: -

Specificità d’ospite Morfologia della placca di lisi

I fagi selvatici possono infettare sia il ceppo B di E.coli sia il ceppo restrittivo K12 di E.coli e la placca di lisi che formano ha margini frastagliati. I mutanti invece possono solo infettare il ceppo B di E.coli e formano una placca con margini lineari. Benzer dimostrò che il locus rII era sotto il controllo di due geni che sono rIIA e rIIB e che i mutanti singoli in questi due geni non sono in grado di infettare il ceppo K12. Produsse circa 20.000 mutanti del locus rII e per rispondere alle sue domande usò: 1) TEST DI COMPLEMENTAZIONE con il quale dimostrò che rII era formato da due geni 2) CON LE COINFEZIONI DI MUTANTI DOPPI IN RIIA O RIIB dimostrò la ricombinazione intragenica 3) UTILIZZO’ LA MAPPATURA PER DELEZIONE per determinare le mutazioni puntiformi sul locus rII

TEST DI COMPLEMENTAZIONE Isola due mutanti che mi danno lo stesso fenotipo: i mutanti non sono in grado di infettare K12. Fa una coinfezione di questi mutanti su un terreno contenente K12: sta producendo eterozigoti in trans per due mutazioni. Una volta avuta coinfezione osserva se si formano le placche di lisi o meno che in termini di test di compplemetazione significa se ho il fenotipo selvatico o se ho il fenotipo mutante. Da test di coinfezione con due mutanti che danno lo stesso fenotipo ottengo placche di lisi cioè ottengo il fenotipo selvatico che è in grado di infettare il ceppo K12 di E.coli. Questo significa che le due mutazioni isolate si trovano su due geni diversi che tra loro complementano e che di conseguenza il locus rII è composto da due geni che chiameremo rIIA e rIIB.

ANALISI DI RICOMBINAZIONE A questo punto sarà assodato che mutazioni nello stesso gene anche se in siti diversi non complementano tra loro. Come si spiega allora che la coinfezione tra due mutanti rIIA produca, anche se raramente, dei fagi T4 wt cioè selvetici? Le due mutazioni in siti diversi dello stesso gene possono ricombinare tra loro dando sia fagi selvatici e sia fagi doppi mutanti. Questo dimostra che la ricombinazione intragenica è possibile e che la più piccola unità di ricombinazione è rappresentata dalla coppia di nucleotidi.

A questo punto Benzer calcolò la frequenza di ricombinazione intragenica e la distanza di mappa tra due mutazioni nello stesso gene. La frequenza di ricombinazione intragenica è data dalla formula: F(RI)= 2 x n di selvatici ricombinanti / progenie totale Mentre la distanza di mappa cioè % di ricombinanti è data da DM = (2x placche su K12 / placche su B ) x 100 Il numero di progenie fagica viene determinata diluendo il lisato e poi piastrando su un ceppo di E. Coli B. Se in un campione diluito 106 volte ci sono 250 placche di lisi, nel campione originario erano presenti 250x106 fagi per unità di volume.

MAPPATURA PER DELEZIONE Le mutazioni prodotte da Benzer ricadevano principalmente in due classi:  Mutazioni per delezione cioè mutanti non revertibili  Mutazioni puntiformi cioè mutanti revertibili Con questo tipo di mutazioni poteva usare la mappatura per delezione per stabilire la posizione di ciascuna mutazione puntiforme. Coinfetta un ceppo di E.coli con mutanti per delezioni e mutanti puntiformi: a) se le due mutazioni sono sovrapposte cioè si trovano nello stesso sito dello stesso gene, non producono ricombinanti wt

b) se le due mutazioni non sono sovrapposte, possono ricombinare e fare il fenotipo wt.

Quindi quando incrocio un mutante per delezione e un mutante puntiforme se non ho il wt vuol dire che le due mutazioni sono sovrapposte e ciò implica che: 1) La regione della delezione contiene la mutazione puntiforme 2) conoscendo la mutazione puntiforme e la regione deleta posso associare ad ogni regione del cromosoma la sua mutazione puntiforme

Esempio banale ma esplicativo Il mio mutante per delezione ha una delezione nella regione 1 che è formata ATTC. Questo mutante viene incrociato con un mutante che presenta una mutazione puntiforme come una inserzione nella regione 1 quindi sarà ATTCG. Li incrocio, le mutazioni sono sovrapposte, non c’è possibilità di ricombinazione. Io sono quindi che la mia mutazione puntiforme che è un inserzione si trova nella regione 1 del cromosoma perché è compresa dalla delezione che si trova nella regione 1 del cromosoma in esame....