4. Técnicas de Siembras y aislamientos PDF

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El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del conocimiento de técnicas de siembra o inoculación y de aislamiento para transferirlos de un medio a otro, o mantener su crecimiento y actividad. Es indispensable para realizar diversos estudios morfológicos, de identificación, bioquímic...

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Técnicas de Siembras y aislamientos OBJETIVOS GENERALES: Que el alumno aplique diferentes técnicas de siembra y aislamiento de cultivos de bacterias en medios sólidos. OBJETIVOS ESPECIFICOS Realizar coloración de Gram para determinar la morfología de las bacterias utilizadas y para adquirir destreza en la elaboración del frotis. MARCO TEORICO. El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del conocimiento de técnicas de siembra o inoculación y de aislamiento para transferirlos de un medio a otro, o mantener su crecimiento y actividad. Es indispensable para realizar diversos estudios morfológicos, de identificación, bioquímicos, de patogenicidad y ecológicos, entre otros. El proceso de colocar las bacterias en medios de cultivo recibe el nombre de SIEMBRA, esta la podemos realizar a partir de muestras biológicas (orina, pues, secreciones, etc.), o de un cultivo bacteriano a otro denominado subcultivo o repique. Para el estudio de las bacterias es necesario conocer tanto su morfología microscópica como macroscópica a partir de su crecimiento en medios de cultivos; estas se observan en las colonias bacterianas; se puede evaluar el comportamiento de ellas frente a los diferentes compuestos nutritivos o proporcionales a aquellos nutrientes que favorezcan su desarrollo. Los elementos importantes para realizar la siembra son: el mechero, asa bacteriológica y los medios de cultivo incubados y atemperados a 37C en la incubadora, contando con estos implementos podemos realizar la siembra. TIPOS DE SIEMBRA. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO EN CAJA DE PETRI. Mediante ella se busca obtener colonias separadas a partir de un inoculo para ello se toma con el asa previamente esterilizado al mechero. La muestra; se coloca en un área periférica de la caja de petri haciendo movimientos circulares para homogenizar el inoculo, precediéndose a usar estrías horizontales con el asa de argolla hasta la mitad o una tercera parte de la caja de petri. Recordar la constitución del medio, por lo tanto, deslizar el asa con suavidad y sin romper el agar. Gire la caja de petri hacia la izquierda y realizar el mismo procedimiento hasta lograr el objetivo final.

SIEMBRA EN TUBO INCLINADO. Para la siembra en tubos con medio solido inclinado en bicel, se realiza movimiento en zic-zac deslizando el asa sobre la superficie y marcando surcos o estrias. Para este tipo de siembras aunque se puedan utilizar los dos tipos de asa bacteriológicas se prefiere el asa recta. Es importante mantener siempre el tubo inclinado para evitar contaminación por bacterias ambientales que proceden de la muestra. Los tapones de algodón o las tapas roscas de los tubos deben manipularse con el dedo meñique y anular de la mano derecha y nunca dejarlo sobre los mesones, ellos pueden contaminar la siembra. Es importante flamear el asa antes de tomar la muestra, y flamear la boca del tubo, no tocar las paredes del tubo con la muestra y devolver el asa a su lugar previamente esterilizada después de haber realizado el procedimiento. SIEMBRA POR PICADURA EN TUBO. Se realiza con el asa recta en medio solido generalmente sin inclinar aunque puede ser en agar inclinado en algunas ocasiones. Se introduce el asa con el inoculo por el centro de la superficie del medio de cultivo y hasta el fondo. No olvidar inclinar el tubo, flamear la boca junto al mechero y manipular correctamente los tapones.

SIEMBRA MIXTA EN TUBO. Se realiza en forma combinada en picadura hasta el fondo del tubo y deslizando el asa por la superficie del agar en bisel marcando estrías. SIEMBRA EN MEDIO LIQUIDO EN TUBO. Se puede utilizar el asa bacteriológica, pipetas estériles, escobillones. Si se utilizan asas bacteriológicas, inocular el asa en el medio liquido haciéndola rotar.

Se debe marcar las cajas los tubos con sus respectivos nombres y fechas. Luego de realizar la siembra se debe proporcionar la temperatura y el tiempo adecuado para la proliferación o crecimiento bacteriano disponiendo de la incubadora o en dado caso un lugar adecuado a temperatura ambiente. Recuerda que las cajas de petri se incuban invertidas para evitar que la condensación que pueda formarse en la tapa de la caja caiga sobre el medio y disperse el crecimiento bacteriano. La morfología de las colonias es un parámetro importante en el proceso de identificación bacteriana siendo las características comunes entre cada género bacteriano. Sin embargo esta morfología puede alterarse por tiempo de incubación, composición del medio de cultivo excesiva desecación de humedad etc. OBSERVACION MACROSCOPICA DE CRECIMIENTO BACTERIANO. Se realiza a través de las características de las colonias aisladas, evaluándose de la siguiente manera: Tamaño= grande, mediano, pequeño, puntiforme. REDONDEADO

ESPICULADO

PLANA

ACUMINADA

PUNTIFIORME

IRREGULAR

ONDULADO

FILAMENTOSO

PLANO CONVEXA

UMBONADA

CIRCULAR

RIZOIDE

LOBULADO

RIZOIDE

CONVEXA

PAPILALDA

FILAMENTOSA

FUSIFORME

PLANA

ACUMINADA

REDONDEADO ESPICULADO

PUNTIFIORME

IRREGULAR

PLANO CONVEXA

UMBONADA

ONDULADO

FILAMENTOSO

CIRCULAR

RIZOIDE

CONVEXA

PAPILALDA

LOBULADO

RIZOIDE

FILAMENTOSA

FUSIFORME

Forma

Borde

Elevación

 Superficie = lisa o rugosa.  Consistencia = blanda, dura o mucoide.  Aspecto = brillante u opaco, traslucido.  Pigmento= amarillo, rojo, verde, etc.  hemolisis= parcial o alfa, total o beta, no hemolisis o gamma. PROCEDIMIENTO. 1.-Limpiar y desinfectar el área de trabajo. 2.- Realizar el frotis para la coloración. 3.- Sembrar por agotamiento en las respectivas cajas de medios de cultivo. 4.- Observar macroscópicamente el crecimiento bacteriano: tamaño, forma, borde, color,...