6 - Advia 2120 - Biotecnologie 2019/2020 PDF

Preview

Summary

Appunti lezione 6 di Patologia Clinica, corso di Biotecnologie, a.a 2019/2020...

Description

ADVIA 2120 E’ un sistema ematologico per la determinazione della parte corpuscolata del sangue, in cui sono presenti meccanismi elettronici, pneumatici, idraulici e di campionamento, oltre che reagenti di lavaggio a bordo dello strumento. E’ un contaglobuli automatico che, dopo aver caricato i campioni, li agita e li distribuisce in 5 diverse camere di reazione attraverso un sistema di valvole. Oltre che per i reagenti, vi è anche un sistema per i reflui (sistema di scarico dei liquidi che vengono eliminati) che si trova all’esterno dell’analizzatore. Le camere di reazione sono zone automatizzate in cui vengono miscelati i reagenti, in particolare vi sono 5 camere di reazioni, la camera perox a temperatura controllata in cui tre reagenti perox vengono miscelati con il campione riscaldato in modo da ottenere la reazione citochimica desiderata. Il canale dell’emoglobina non è visibile ma funge da cuvetta ottica in cui viene eseguita la lettura spettrometrica dei valori di emoglobina. Le camere di reazione dei globuli rossi e piastrine,e separatamente per i reticolociti, fungono da contenitori nei quali avviene la miscelazione dei reagenti e dei campioni per ottenere la reazione desiderata. Una volta effettuate le reazioni nelle cinque camere, vengono inviate alle cellette per l’analisi e al termine queste miscele di campioni e reagenti vengono caricati nei contenitori di rifiuti mentre le camere di reazioni vengono appropriatamente risciacquate.Lo strumento è dotato anche della capacità di aspirare i campioni manualmente attraverso una valvola campionatrice per provette chiuse e aperte situata all’esterno. La quantità di campione che normalmente viene aspirata è pari a 175 microlitri ed è uno strumento abbastanza veloce in quanto riesce ad analizzare anche 120 campioni all’ora nel caso in cui venisse richiesto l’emocromo con formula leucocitaria e 74 campioni all’ora nel caso in cui venga rischiesta l’analisi dei reticolociti. Il principio di base dell’ADVIA 2120 sfrutta gli elementi della citometria a flusso*: gli elementi cellulari presenti nel sangue vengono aspirati, allineati in fila indiana e colpiti con una luce laser monocromatica. Questa luce viene poi raccolta da sistemi ottici, che a seconda degli angoli che si formano dà informazioni diverse: ● lo Scatter Low Angle (con un gruppo ottico posto a 2° - 3°)→dà informazioni sulla grandezza degli elementi cellulari; ● lo Scatter High Angle (con un gruppo ottico posto a 5° - 15°)→dà informazioni sulla complessità cellulare (es. combinazione tra la forma del nucleo e la densità cellulare); Si distinguono in realtà tre gruppi ottici: 1. il gruppo ottico Perox → per la distinzione dei globuli bianchi; 2. il gruppo ottico Laser→per la distinzione di globuli rossi, reticolociti, basofili e piastrine; 3. il gruppo colorimetrico dell’emoglobina in cui avviene una reazione spettrometrica per la lettura dell’emoglobina stessa. METODI PER LA CARATTERIZZAZIONE ➢ Alla serie rossa sono dedicati tre canali: ● METODO RBC/PIASTRINE (RBC = red blood cells - globuli rossi) →è un metodo unico sia per il conteggio dei globuli rossi che per le piastrine; ● METODO EMOGLOBINA (HGB)→ dà un segnale spettrofotometrico; ● METODO RETICOLOCITI →sfrutta il fatto che alcuni reticolociti hanno ancora RNA che viene evidenziato e modificato; ➢ Alla serie bianca sono dedicati due canali: ● METODO PEROSSIDASI; ● METODO BASOFILI/LOBULARITÀ *sfericizzati in modo isovolumetrico = vengono curvati senza variazioni dal punto di vista del volume 1. METODO RBC/PIASTRINE Eritrociti e piastrine vengono analizzati sullo stesso canale. Questo metodo consiste in una serie di reazioni, ma principalmente si possono distinguere due fasi: 1. Piastrine ed eritrociti vengono sfericizzati in modo isovolumetrico* con un reagente idoneo (glutaraldeide + SDS): questa sfericizzazione fa perdere gli aspetti relativi alla morfologia cellulare e serve per analizzare meglio i risultati (vengono uniformati per quanto riguarda la forma);

2. RBC e PLT (=piastrine) vengono fissati. A questo punto vengono rilevati i segnali di scatter, ovvero: (viene utilizzata la teoria di Mie sulla dispersione della luce per sfere omogenee) ● il light scattering→che valuterà il volume di eritrociti e piastrine; ● lo scatter high angle→che dà informazioni sulla complessità eritrocitaria (sulla concentrazione di Hb) che vengono amplificati elettronicamente e divisi in 4 segnali: ● una coppia di segnali low (da 2° a 3°) e high angle (da 5° a 15°) viene utilizzata per analizzare i globuli rossi; ● per le piastrine i segnali vengono amplificati perchè sono più piccole: il segnale di scatter low angle viene amplificato di 30 volte; mentre il segnale di high angle viene amplificato di 12 volte.

Queste informazioni vengono poi rappresentate su istogrammi o citogrammi in cui sull’asse delle x si ha la complessità cellulare, cioè la concentrazione di emoglobina; mentre sull’asse delle y il volume cellulare. Il tutto viene distribuito su 9 quadranti che indicheranno come si distribuiscono gli eventi relativi al volume e alla concentrazione di Hb: ● VOLUME - tra i 60 e 120 fL vi sono i normociti; - oltre i 120 fL sono macrociti; - sotto i 60 fL sono microciti ● EMOGLOBINA - tra i 28 e i 41 g/dL sono normocromici; - sotto i 28 g/dL sono ipocromici; - sopra i 41 g/dL sono ipercromici; Ovviamente bisogna anche tenere conto dell’RDW (ampiezza di distribuzione di volume eritrocitario) e dell’HDW (ampiezza di distribuzione dell’emoglobina), indicano se la distribuzione è omogenea: ci possono essere elementi cellulari che non corrispondono ai valori volumetrici o di concentrazione emoglobinica: - si parla di anisocitosi→quando viene superato il valore di 1,6 fL; - si parla di anisocromia→quando viene superato il valore di 3,4 g/dL

- anemie da carenze di ferro→più della metà sono microcitemici e ipocromici; - beta talassemica con carenza di ferro →(alcuni con ipocromici e microcitemici); - anemia emolitica a causa di agglutinine fredde→il sistema è stato ingannato perchè le agglutinine fredde sono Ab contro gli eritrociti che si sono depositati sulla superficie dell’eritrocita e hanno fatto in modo che il laser considerasse il tutto una cellula più grande.

➢ PIASTRINE

L’ADVIA 2120 riesce a identificarle e quantificarle con un metodo bi-dimensionale che misura il loro volume e l’indice di rifrazione (ovviamente previa amplificazione del segnale). Anche in questo caso i valori vengono riportati su istogrammi e citogrammi. Bisogna tenere conto dei paramentri: ● MPV→volume piastrinico medio; ● PDW (ampiezza di distribuzione piastrinica, grado di anisocitosi)→indica quanto sono diverse le piastrine l’una dall’altra dal punto di vista della grandezza; ● Pct (piastrinocrito)→determinazione del numero totale di piastrine nel campione di sangue. L’MPV può essere aumentato: - quando vengono messe in circolo piastrine giovani; - dopo splenectomia (asportazione milza); - piastrinopenie* da distribuzione periferica→*conta piastrinica anormale L’MPV può essere diminuito: - piastrinopenie da ipofunzione midollare (es. chemioterapia) Le linee guida raccomandano di non riportare sul referto i valori di PDW e Pct perchè sarebbe troppo dettagliato, mentre deve essere chiaro per chi lo legge. ● Problemi analitici legati alle piastrine il problema principale è la cosiddetta pseudopiastrinopenia, si costituiscono degli aggregati che dallo strumento vengono letti come unico elemento cellulare, quindi il numero delle piastrine viene sottostimato. In questo caso bisogna ripetere il prelievo, o l’esame sullo stesso prelievo ispezionando il campione controluce prima di caricarlo sullo strumento, in quanto la formazione di microcoaguli è un evento abbastanza frequente. 2. METODO EMOGLOBINA (HGB) Il metodo utilizzato è il cosiddetto “metodo di Bayer”. Le reazioni chimiche sono composte da due fasi: ● gli eritrociti vengono lisati con tensioattivo 0,5 N di sodio idrossido (NaOH) con pH 13.7 (abbastanza basico) per liberare l’emoglobina →pH alcalino e tensioattivo causano denaturazione della proteina e solubilizzazione dell’eme; ● il ferro dell’eme viene ossidato dallo stato ferroso (2+) allo stato ferrico (3+) e viene combinato con un reagente adatto per formare un prodotto di reazione colorato che verrà letto fotometricamente a 546 nm. Prima si usava il cianuro, ma poi è stato sostituito con un prodotto meno dannoso in quanto era cancerogeno. Questo canale può risentire di alcune interferenze in quanto si tratta di una reazione cromogenica (che quindi misurerà sicuramente la presenza di altre sostanze che per natura sono presenti: - emolisi da prelievo (la rottura degli eritrociti rende il plasma non più giallo ma rosso); - ittero (condizione in cui la bilirubina è aumentata e quindi il plasma è di un giallo più intenso); - lipemia (colore più biancastro del sangue) 3. METODO RETICOLOCITI Ė composto da 2 fasi: 1. RBC e PLT vengono sfericizzati isovolumetricamente con il reagente AVIA 120 RBC/PLT; 2. i reticolociti vengono colorati in modo diverso a seconda del loro contenuto in RNA attraverso l’Oxazina 750 - quelli più maturi avranno meno RNA. Le informazioni che si ottengono mediante questo metodo riguardano: - la concentrazione di Hb, che nei reticolociti è minore; - il volume→i reticolociti sono più grandi dei globuli rossi maturi. Si ottengono informazioni anche sui parametri MCVr, CHMCr, RDWr, HDWr e CHr (=concentrazione Hb) che sono designati con una “r” che indica appunto sono relativi ai reticolociti. L’analisi dei reticolociti consente di valutare l’eritropoiesi senza ricorrere a manovre invasive: ● un valore di RET basso è dovuto a → inadeguata risposta midollare (nel caso di carenza di Fe, folati, vit. B12); neoplasie a carico del midollo (processi infiltrativi che occupano spazio e ne tolgono agli elementi deputati alla produzione della linea eritropoietica); nefropatia (il rene produce eritropoietina essenziale per l’eritropoiesi),

●

un valore di RET alto è dovuto a → perdite ematiche acute o emolisi; condizioni di ipossia (es. ad alta quota) perchè si cerca di compensare la rarefazione dell’ossigeno; è alto anche nei fumatori, in gravidanza e nei neonati.

METODI DI CARATTERIZZAZIONE PER LA SERIE BIANCA Sono due: 1. Metodo Perox; 2. Metodo basofili/lobularità in questo caso viene sfruttata l’attività perossidasica che hanno alcune di queste cellule: - positivi alla perossidasi sono maggiormente gli eosinofili, poi i neutrofili e debolmente positivi i monociti; - i negativi alla perossidasi sono i linfociti e i basofili, che quindi non si coloreranno; così come anche le cosiddette cellule LUC (Large unstained cells), cioè cellule talmente grandi dal punto di vista morfologico che non si colorano, come ad esempio le plasmacellule o i blasti. METODO PEROSSIDASI Le reazioni citochimiche della perossidasi sono composte da tre fasi: ● gli eritrociti vengono emolizzati usando il reagente PEROX 1 ad una elevata temperatura; ● i leucociti vengono fissati con lo stesso reagente; ● i leucociti vengono fissati con il reagente PEROX 2 e PEROX 3. Quindi gli eritrociti si sciolgono; i leucociti con attività perossidasica si colorano e quelli senza attività perossidasica rimangono incolore. Perox 1 è costituito da SDS, formaldeide, sorbitolo e ha un pH 7.2. In presenza di perossido di idrogeno e 4-cloro-1-naftolo, la perossidasi all’interno della cellula determinerà la formazione di un precipitato nero. Dopo colorazione le cellule passeranno attraverso un duplice sistema di rilevazione in campo scuro: viene misurato il volume delle cellule e poi l’attività perossidasica per assorbimento del segnale: le cellule con attività perossidasica media assorbono meno luce (sono meno cromate) rispetto a quelle con alta attività perossidasica→ l'intensità di colorazione è proporzionale all’assorbanza. Tutto ciò viene poi riportato su un citogramma in cui sull’asse delle x sarà inserita l’attività perossidasica e sull’asse delle y il volume cellulare. METODO BASOFILI/LOBULARITÀ Sfrutta la resistenza della membrana dei basofili al detergente rispetto alla membrana degli altri elementi cellulari. Le reazioni citochimiche sono costituite da due fasi: ● RGB e piastrine vengono lisati; ● i globuli bianchi vengono trattati con il reagente ADVIA 120 BASO: tutti saranno privati del loro citoplasma per rottura della membrana plasmatica, tranne i basofili, che saranno le uniche cellule ad essere rimaste integre e questo consentirà la loro distinzione e quindi la loro quantificazione. Sul citogramma, sull’asse delle x è riportata la complessità dei nuclei (visto che il citoplasma è stato allontanato) e sull’asse delle y il volume cellulare→le cellule più grandi saranno i basofili perchè sono rimaste intatte; e poi ci saranno i mononucleati (monociti e linfociti) e i polimorfonucleati (neutrofili ed eosinofili). Questo metodo consente anche di misurare l’indice di lobularità→ il rapporto tra i nuclei complessi dei PMN e i nuclei più semplici dei mononucleati: ● se è < di 1,9 si ha un “left shift”→spostamento verso sx nel citogramma, cioè verso forme di nuclei meno complessi, ad esempio come quelli delle cellule immature e ci saranno quindi i blasti, che sono correlati con leucemie acute, linfomi, mielofibrosi ecc. ● inoltre si possono verificare una serie di allarmi morfologici che segnalano la presenza di cellule anomale: aggregati piastrinici, la presenza di micro e macrocitosi, grandi piastrine ecc. Uno dei pochi difetti di questo strumento è che per i soggetti mieloperossidasi-negativi non permette di effettuare la formula leucocitaria. ➢ METODO nRBC

Una sua particolarità è che permette di conteggiare gli eritroblasti per sottrazione dei reticolociti. Gli eritroblasti (nRBC) sono i precursori immaturi dei globuli rossi e possiedono il nucleo. Di norma si trovano esclusivamente nel midollo osseo e quindi ritrovarli nel sangue periferico (nel campione) non è normale, e per questo è importante segnalarne la presenza. Il metodo è basato sulle caratteristiche fisiche (dimensione e densità dei nuclei) e citochimiche (perox) degli eritroblasti e il loro conteggio avviene combinando le misure dei due canali perox e barox. Possono essere presenti in casi di: - prematurità; - intensa stimolazione dell’eritropoietina (anemia emolitica, talassemia o anemia falciforme); - malattie ematopoietiche (linfomi o leucemie); - severa ipossia (insufficienza cardiaca e polmonare, gravi emorragie, acidosi metabolica). I REFERTI Sono riportati nome, cognome, età del pz e reparto. I valori possono essere riportati in: ● Grigio = risultati nei limiti, nella norma; ● Giallo = risultato fuori norma (al di sotto, giallo chiaro) - (al di sopra, giallo scuro); ● Rosso = risultato al di fuori dei limiti stabiliti dal laboratorio; ● valori asteriscati * = problema dal punto di vista tecnico...