6. Recombinación homóloga PDF

Preview

Summary

RecombinaciónRecombinación homólogaLa recombinación homóloga sirve para: Contribuye a la reparación de varias lesiones del DNA.  Actúa en la reconstrucción de las horquillas de replicación bloqueadas en las lesiones del DNA.  Proporciona en las células eucarióticas una unión física transitoria en...

Description

Recombinación Recombinación homóloga La recombinación homóloga sirve para: 

Contribuye a la reparación de varias lesiones del DNA.



Actúa en la reconstrucción de las horquillas de replicación bloqueadas en las lesiones del DNA.



Proporciona en las células eucarióticas una unión física transitoria entre las cromátidas hermanas que es necesaria para la segregación ordenada de los cromosomas en la primera división celular mitótica.



Permite el proceso de crossing over (recombinación meiótica).



Contribuye a la diversidad genética de una población.

Pasos fundamentales para la recombinación homóloga: 1º. Alineación de dos moléculas de DNA homólogas (aunque pueden existir regiones con secuencias diferentes) 2º. Introducción de roturas en el DNA: pueden involucrar una o ambas cadenas. 3º. Formación de regiones cortas iniciales de apareamiento de bases entre las dos moléculas de DNA (invasión de las cadenas, una región monocatenaria de DNA se aparea con su cadena complementaria en la molécula de DNA dúplex homóloga mediante el cruce Holliday) 4º. Movimiento de la unión Holliday mediante la desnaturalización y el apareamiento de bases (migran las ramas) 5º. Escisión de la unión Holliday

Modelo holliday 1.

Duplex homólogos alineados: moléculas casi idénticas, con alelos diferentes de cada gen.

2.

Se producen roturas monocatenarias en cada dúplex

3.

Las cadenas de DNA cerca del sitio de corte, se despegan de sus complementarias, liberándose para invadir el dúplex homólogo y luego aparearse con él generando la

4.

unión de Holliday La unión Holliday se mueve generando apareamientos incorrectos

5.

Se rota la unión Holliday. La unión de Holliday puede escindirse de dos formas diferentes generando dos

6.

Al cortar en V, aparece un producto recombinante con redistribución de genes flanqueados.

7.

Al cortar por H, aparecen productos no recombinantes, no hay redistribución.

productos distintos.

1

Modelo de reparación de roturas bicatenarias – DSB Esta recombinación ocurre cuando ambas cadenas están dañadas (DSB = Double Strand Break), o cuando se mantiene una lesión de cadena simple porque no funcionaron otros mecanismos, la horquilla de replicación se atasca o se detiene. Estos DSB son generalmente causados por especies reactivas de oxígeno generadas por el metabolismo celular o por radiaciones ionizantes. Si no se repara se pueden producir reordenamientos y aberraciones cromosómicas que llevan a la muerte celular. El DSB se repara por HR o por la unión no-homóloga de los extremos , unión de extremos no homólogos (NHEJ – Nonhomologous end joining).Ambos mecanismos presentan diferencias significativas entre sí y con respecto a l taza de error que promueven. DSB, se inicia con los cromosomas homólogos alineados pero se introduce un corte DSB en una de las dos moléculas de DNA (verde) y el otro permanece intacto (rosa) Una enzima, Rec BCD degrada el 5’ del DNA de modo secuencial generando regiones de DNA monocatenarios (cola de ssDNA) que terminan en extremos 3’. Estas colas de ssDNA invaden el dúplex de DNA homólogo no roto y cada cadena invasora se aparea con su complementaria en la otra molécula de DNA. Como cada cadena invasora termina con extremos 3’, pueden servir como cebadores para la síntesis de DNA nuevo (amarillo). El alargamiento desde otros extremos utiliza la cadena complementaria en el dúplex homólogo como molde y sirve para regenerar las regiones del DNA que se destruyeron durante el procesamiento de las cadenas en el sitio de la rotura. Así se forman dos uniones Holliday que se mueven por migración de la ramas y según donde se produzca el corte se obtendrán diferentes productos.

Recombinación no homóloga o NHEJ Es un mecanismo de reparación imperfecto, ya que se pierden algunas secuencias. Esto es menos dañino que dejar los extremos libres para que inicien reordenamientos cromosomales. Esta situación es análoga al resultado del mecanismo SOS. Cuando se producen DSB en moléculas de DNA, dos proteínas DNA-PK junto con el heterodímero se unen cada una a uno de los extremos dañados y se mantienen unidas entre sí, mientras se activa su actividad exonucleasa y degradan la protuberancia que podría tener la cadena rota. Una vez que se pulieron los extremos, actúa la DNA ligasa promoviendo la unión, y dando lugar a una nueva molécula de DNA.

2

Proteínas que catalizan la recombinación homóloga Factores Procarióticos y Eucarióticos que catalizan los pasos de la rcombinación Proteína catalítica en E. Paso de recombinación coli Emparejamiento homólogo e invasión de la cadena simple Rec A Introducción del DSB

Ninguna

Procesamiento de las roturas del DNA para generar cadenas simples por invasión Montaje de las proteínas de cambio en la cadena Reconocimiento del intermediario cruciforme de Holliday y migración de las ramas Resolución

RecBCD helicasa/nucleasa RecBCD y RecFOR Complejo RuvAB

Proteína catalítica en eucariotas*

1

Rad51 Dcm1 (en meiosis) Spo11 (en meiosis) HO (apareamiento de conmutación) MRX (también llamada nucleasa Rad50/58/60) Rad52 y Rad59 Desconocido

RuvC

Quizás el complejo Rad51c-XRCC3 y otros *1 En eucariotas también funciona la reparación de DSB pero con proteínas análogos funcionales a las de Coli.

El proceso de recombinación homóloga (Meiosis – Crossing over) 1) Apeareamiento de dos hebras de DNA homólogo. 2) Generación de una región simple cadena de DNA (ssDNA) por la acción de RecBCD. 3) Invasión de la ssDNA sobre la cadena homóloga dsDNA mediada por RecA. 4) Formación de la estructura Holliday y migración de la rama con la participación de RuvAB. 5) Resolución de la estructura Holliday por RuvC.

Apareamiento de dos hebras de DNA homólogo El apareamiento de las hebras de DNA homólogo es el inicio de la reconmbinación y ocurre en la meiosis después de la replicación de los cromosomas. Los homólogos se aproximan y comienzan a aparearse en una o más regiones formando los bivalentes. Este apareamiento se extiende hasta que la longitud entera de cada cromosoma está unida con su homólogo. Este proceso se llama sinapsis o apareamiento de cromosomas.

Generación de una ssDNA por la acción de RecBCD, El complejo RecBCD tiene actividad helicasa y actividad nucleasa en primer lugar, actúa sobre un extremo libre de DNA abriéndolo mediante la actividad helicasa. La actividad nucleasa degrada preferentemente la banda de arriba del DNA, hasta que el complejo proteico llega a un lugar con una secuencia específica llamada chi (χ), donde RecBCD se detiene y cambia la polaridad, degrada preferentemente la cadena de abajo. Al reconocer la secuencia chi, RecBCD promueve el ensamblaje de la proteína RecA que se une a la cadena 3' → 5', favoreciendo la iniciación de la recombinación, a la vez que también se atenúa la actividad nucleasa por pérdida o inactivación de RecD. Al final, luego del ensamblaje de RecA, se disocia RecBCD y se reactiva su actividad nucleasa. El mecanismo de acción de RecBCD puede representarse como sigue:

3

Tanto la subunidad RecB como la RecD son ATPasas DNA dependientes. La actividad RecBCD se ve inhibida por sus productos de acción (fragmentos pequeños de ssDNA), esta inhibición se alivia en presencia de SSB . En -

mutantes recA RecBCD encuentra la secuencia y no pierde su actividad nucleasa sugiriendo que RecA interviene de alguna manera junto a dicha secuencia en el proceso de inactivación. La secuencias chi son hot spots de recombinación, sitios donde se da una frecuencia de recombinación más elevada de lo normal: 5' GCTGGTGG 3' CGACCACC 5'

3'

Invasión de la ssDNA sobre la cadena homóloga dsDNA mediada por RecA RecA se arma sobre un ssDNAy busca una región homóloga en un dsDNA, para esto debe detectar la complementariedad de bases y lo logra porque tiene 2 sitios de unión al DNA. Al encontrar la región homóloga se intercambiarán bandas, originándose el intermediario de Holliday.

4

Reconocimiento de la estructura Holliday y migración de la rama con la participación de RuvAB, RuvA reconoce el sitio de entrecruzamiento (intermedio de Holliday)y se une al DNA, RuvB es una helicasa que como tal, tiene actividad ATPasa, la que aporta energía para la migración de la rama. RuvB se une a Ruv y es así que se une a la estructura Holliday pues ella por sí sola no es capaz de hacerlo. La actividad ATPasa de RuvB conduce a un retorcimiento en el DNA, halando los dúplex recombinantes a través de la matriz de RuvA, donde ocurre el intercambio de cadenas, proporcionando el motor para la migración de la rama. El siguiente esquema muestra la posible disposición del complejo RuvAB sobre el punto de entrecruzamiento

Resolución de la estructura Holliday por RuvC. RuvC , codifica para una endonucleasa que reconoce específicamente las uniones Holliday, corta y une para dar lugar a las cadenas recombinantes, por lo tanto es la que realmente resuelve el intermedio de Holliday..

La ocurrencia de la recombinación es necesaria para el progreso a través de la meiosis y se ha observado que la meiosis es bloqueada si no hay recombinación.

Recombinación sitio específica La recombinación sitio específica sirve para:



Regulación de la expresión de ciertos genes.



Promoción de reordenamientos programados del DNA durante el desarrollo de muchos organismos.



Involucrados en ciclos de replicación de algunos DNAs de virus y plásmidos.

Ejemplos: 

Recombinasa Cre – sitios loxP (fago P1)



Integrasa Int del fago λ – sitios att (attP y attB)

Ambos fagos pueden introducir su DNA en el DNA de la bacteria.

5

Esta recombinación es un tipo de recombinación especializada porque ocurre entre pares específicos de secuencias cortas de DNA. Estas secuencias pueden encontrarse sobre un mismo cromosoma o en diferentes. En este caso la recombinación no está guiada por dichas secuencias cortas, sino que depende de enzimas especializadas en reconocer dichas secuencias y catalizar cortes dentro o cerca de las secuencias y su reunión, para dar productos recombinantes. Este tipo de recombinación conduce generalmente a un reordenamiento de la información Al igual que la recombinación homologa, la recombinación específica de sitio produce muchas variantes genéticas de las que depende la evolución. Y puede producirse a través de dos mecanismos: CSSR: Recombinación conservativa sitio específica: Necesita que se forme un heteroduplex muy corto y una secuencia de DNA que se encuentre tanto en la molécula dadora como en la aceptora (no hay intercambio reciproco). TSSR: Recombinación transposicional sitio específica: implican reacciones que cortan los extremos de los segmentos de DNA móviles insertados en los cromosomas y de unión de dichos extremos con muchos lugares no homólogos del DNA target. No requiere la formación de un heteroduplex de DNA.

Reordenamiento génico (cuando las secuencias están en el mismo cromosoma) El reordenamiento génico se promueve por la recombinación entre dos secuencias específicas o dos copias de un elemento transponible. Si dichas secuencias se encuentran en un mismo cromosoma, se habla entonces de repeticiones (repeats) que pueden ser directas (RDs) o inversas (RIs) y el resultado de la recombinación depende de la orientación de las repeticiones (orientación referida al orden de nucleótidos y no a la dirección de la cadena, 3' → 5' ó 5' → 3'), como indica la figura siguiente (donde las repeticiones se representan en rojo y verde, respectivamente):

Si se trata de secuencias con orientación inversa (RIs) el segmento de DNA que se encontraba entre las RIs queda invertido tras la recombinación, caso (a) de la figura anterior. Por el contrario, si se trata de repeticiones directas (en la misma orientación), después de ocurrir la recombinación el elemento intermedio queda delecionado como un círculo de DNA, que es el caso (b) de la figura anterior.

6

Integración del fago λ al cromosoma bacteriano (cuando las secuencias no están en el mismo cromosoma) Cuando las secuencias se encuentran en moléculas diferentes, el fragmento se integra al DNA. Como ejemplo de esta recombinación vamos a estudiar la integración del Fago lambda al cromosoma bacteriano. El mecanismo general se representa en la figura siguiente: El sitio de integración del fago se llama attP o POP’ (attachment Phage), e interacciona con el sitio de integración attB o BOB’ de la bacteria (attachment Bacteria). Aunque no existe homología de secuencia entre attP y attB, existe una región de 15 pb que es idéntica en ambos, esa región se llama O . La recombinación se da entre los sitios O de modo que al integrarse el DNA del fago en el DNA de la bacteria, el profago (DNA de fago integrado) quedará flanqueado por dos nuevos sitios: BOP'o attL y POB'o attR . Estos sitios attL y R están involucrados en la escisión del profago que transcurre por el mecanismo opuesto al de la integración. Ello implica que los eventos de recombinación para lograr la integración y la escisión son "reversibles" aunque se dan en condiciones diferentes. El conjunto de proteínas que participan en uno y otro porceso se resumen en la siguiente tabla:

1

Reacción

Recombinantes

Integración

AttB x AttP

Escisión

AttL x AttR

Genes y enzimas que participan Fago lambda Bacteria Int IHF (Factor de integración del hospedero), genes himA 1 y himD Xis, Int IHF

Es una proteína de 20 kD, no esencial para la E. coli y no requerida para la recombinación homóloga bacterial. Tiene la habilidad de enrollar DNA en su superficie.

La proteína int o Tyr recombinasa tiene las actividades típicas de una recombinación, endonucleasa y ligasa. Introduce dos cortes no enfrentados, , tanto en attP como en attB y se unen unos extremos con otros, la secuencia tiene que ser la misma para que se apareen. Dos proteínas int cortan y ligan, dando lugar a una estructura similar a la del intermedio de Holliday. Realmente no es un verdadero intermedio de Holliday, ya que el punto de cruce no puede desplazarse. Este intermedio lo resuelven las otras dos moléculas de int, actuando de la misma manera, es decir, cortando y uniendo. El mecanismo puede representarse como sigue (los círculos grises representan subunidades de int):

7

Mecanismo detallado: Paso 1: Sinapsis Estas recombinasas reconocen y se fijan en cada uno de los sitios de recombinación en dos moléculas de DNA diferentes o dentro del mismo DNA dando lugar a un tetrámero. En este sitio se corta una cadena de DNA en un punto específico, y la recombinasa queda unida covalentemente al DNA en el sitio de corte, mediante un enlace fosfotirosina. El nucleófilo es el grupo OH de un residuo de TYR ubicado en el sitio activo de la enzima y el producto es un enlace covalente DNAproteína. El enlace transitorio proteína-DNA conserva el enlace fosfodiéster perdido en el corte de DNA, haciendo innecesario los cofactores de elevada energía como el ATP en los pasos posteriores. Paso 2: Intermediario de Holliday  Las hebras de DNA cortadas se unen a nuevas hebras, formando un intermediario de Holliday con nuevos enlaces fosfodiéster, creados a expensas de la unión proteínaDNA. Paso 3 y Paso 4: Finalización Para concluir con la reacción, el proceso de ha de repetir en un segundo punto dentro de cada uno de los dos sitios de recombinación. En algunos sistemas, ambas hebras de cada sitio de recombinación serán cortadas a la vez y unidas a las nuevas hebras sin intermediario de Holliday. El intercambio es siempre preciso y recíproco, de modo que los sitios de recombinación son regenerados una vez completada la reacción. La recombinasa puede considerarse a la vez como una nucleasa especifica de sitio y una ligasa. Toda la reacción se lleva a cabo en un complejo de múltiples subunidades de recombinasa, que a su vez incluye otras proteínas.

Bacteriófago P1 Este posee la recombinasa Cre, compuesta por dos subunidades de escisión, cada una de las cuales se une covalentemente a la cadena de DNA por un puente de fosfotirosina. Durante la replicación del fago P1, se producen largos DNAs multiméricos, que son resueltos en moléculas de DNA de P1 por la recombinación entre los sitios loxP, que separan cada monómero de DNA componente del multimero. La proteína Cre ( Causa Recombinación) es codificada por el fago, y cataliza la recombinación entre los sitios loxP, generando los ya mencionados DNAs monoméricos, según: Los sitios LoxP son los lugares de recombinación. Son sitios simétricos:

Esta recombinación es un tipo de recombinación especializada porque ocurre entre pares específicos de secuencias cortas de DNA. Estas secuencias pueden encontrarse sobre un mismo cromosoma o en diferentes. En este caso la recombinación no está guiada por dichas secuencias cortas, sino que depende de enzimas especializadas en reconocer dichas secuencias y catalizar cortes dentro o cerca de las secuencias y su reunión, para dar productos recombinantes. Este tipo de recombinación conduce generalmente a un reordenamiento de la información.

8

Formación de anticuerpos La recombinación sitio específica conservativa también se usa como base molecular para la generación de anticuerpos (inmunoglobulinas). Estos tienen epitopes que pueden reconocer una secuencia especifica o una estructura especifica. En el cuerpo 10 hay ~10 anticuerpos diferentes, pero no puede existir un gen para cada uno de ellos. Por esto, sus genes se dividen en módulos, que se combinan para dar lugar a diferentes organizaciones. Para la cadena liviana hay tres módulos que varían dando lugar a muchas posibilidades diferentes; estos son: 

V: variante (de una a ~300 posibilidades)



P: de junta (hay 4 posibilidades)



C: segmento constante (es uno solo)

Lo mismo sucede en la cadena pesada, con la diferencia que en la pesada hay 4 módulos diferentes (V, D, J, C) en lugar de solo 3. Y un proceso similar de CSSR se utiliza para la generación de los receptores del sistema inmune. El esquema de la recombinación necesaria para que se den estas reorganizaciones en el genoma y podamos tener así una gran variedad de anticuerpos y receptores.

Conversión Génica En la conversión génica, por ejemplo se producen tres copias del alelo materno y una sola del alelo paterno. El fenómeno se estudió en levaduras porque los 4 productos meióticos se pueden estudiar en la progenie haploide de los esporos. Tanto el dúplex recombinante como el no recombinante pueden quedar con regiones heteroduplex DD´, con bases mal apareadas. El sistema de reparación “mismatch” corregirá D la mitad del tiempo y D´ la otra mitad. De esta forma, 3 de cada 4 esporos haploides de las levaduras llevarán el fenotipo D y uno el D´ o viceversa.

9

Aplicaciones de la RH Gene Knock out El bloqueo de genes (en inglés, gene knockout) es una técnica genética que consiste en suprimir la expresión de un gen específico en un organismo (un ratón, una planta, una levadura...), sustituyendo el gen original en su locus por una versión modificada del mismo, a la que se ha extraído uno o varios exones para generar una versión no funcional, incapaz de producir la proteína que codificaba el gen original. El gen modificado (que carece la mayor parte de la secuencia del gen original) se introduce en un plásmido, para generar un vector direccionador (targeting vector). En dicho vector, el gen modificado está controlado por un promotor que permite la expresión del gen. El plásmido debe incluir la presencia de un marcador (norm...