7- Immunologia generazione delle immunoglobuline nelle cellule B PDF

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Tutti i processi dettagliati che portano alla generazione delle immunoglobuline nelle cellule B nella risposta immunitaria adattativa...

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GENERAZIONE DELLE IMMUNOGLOBULINE NELLE CELLULE B Cellule B e riarrangiamento genetico La produzione delle immunoglobuline è molto complessa e avviene grazie a dei meccanismi molecolari che coinvolgono il riarrangiamento genetico. Il riarrangiamento genetico è un meccanismo che coinvolge il DNA a livello delle cellule somatiche. Si parla di riarrangiamento somatico e avviene in tutti i linfociti (in questo caso linfociti B, ma vale anche per i T). Ciò accade perché nelle cellule B i loci delle catene pesanti e leggere non contengono singoli geni, ma segmenti genetici disposti sequenzialmente lungo il cromosoma. Ciascuna serie di segmenti contiene versioni alternative (seq aminoacidiche diverse) di parti della regione variabile. Questo tratto di genoma, quindi la sequenza, viene ereditato attraverso la linea germinale e per questo tale arrangiamento è detto configurazione della linea germinale o forma germinale. Mentre il riarrangiamento genico di queste sequenze è dato da una ricombinazione somatica. Quindi: • riarrangiamento genico: i segmenti devono essere assemblati per formare un gene funzionale che codifica per la regione variabile sia della catena pesante sia di quella leggera; • ricombinazione somatica: è la particolare ricombinazione genica che si verifica solo durante la maturazione dei linfociti dai loro precursori presenti nel midollo. Il risultato del repertorio dei recettori per gli antigeni è il risultato dell’unione di molteplici segmenti genici che codificano le catene dei recettori dei linfociti B durante lo sviluppo di ogni linfocita. Organizzazione germinale Sul DNA di tutte le cellule si ha la stessa struttura (es nell’immagine). Sul cromosoma 22 abbiamo il locus della catena leggera λ, sul cromosoma 2 abbiamo il locus della catena leggera k e sul cromosoma 14 abbiamo il locus della catena pesante. Guardando i loci delle catene leggere abbiamo le sequenze L che sono i peptidi Leader che sono tanti quanti sono le sequenze variabili. Le sequenza variabili sono le sequenza V che sono segmenti genici cioè quelle sequenze che devono essere riarrangiate perché non sono geni, ma delle sequenze che affinché possano essere trascritte e dare proteine, devono essere riarrangiate. Per la catena leggera del cromosoma 22 si hanno 30 segmenti genici variabili che possono essere riarrangianti, ogni sequenza porta il suo peptide segnale davanti; ci sono poi le sequenze J che sono dette sequenza di giunzione che servono a congiungere la regione variabile e la regione costante C del cromosoma (infatti la catena leggera λ è fatta da una regione variabile ed una costante), le regioni costanti sono 4 perché λ può avere 4 differenti isotipi di immunoglobuline. L’isotipo è dato dalla regione costante che si lega, mentre la regione variabile determina il tipo di legame dell’epitopo. Quindi per la catena leggera λ possiamo ricombinare una delle 30 porzioni variabili con uno dei 4 isotipi, quindi si hanno 30x4=120 possibili catene leggere λ. Sul cromosoma 2 c’è invece il locus per la catena leggera k. La differenza fondamentale tra la catena λ e k è nella giunzione J dove le sequenze J non sono legate alle varie strutture isotipiche perché la catena k ha un unico isotipo. Quindi la variabilità è data dalle 5 sequenze di giunzione J che si vanno a legare all’unico isotipo della regione costante CK. In questo caso si hanno 35 regioni variabili che possono ricombinare con le 5 sequenze J. Quindi si avranno 35 possibilità diverse di creare variabilità di legame. Bisogna ricordare sempre che mentre le regioni variabili Vλ, VK e VH e J sono segmenti genici (soggetti a ricombinazione somatica), le regioni Cλ, CK e CH sono geni veri e propri. Quindi C verrà trascritto indipendentemente.

Il locus della catena pesante ha una sequenza genica in più che è la sequenza D, detta sequenza di diversità, che si interpone tra le sequenza V e J. Queste sequenza D sono anche loro dei segmenti genici (ricombinazione somatica). Si può vedere che la regione variabile ha 40 sequenze di segmenti, se sequenze di diversità sono 23, ci sono 6 sequenze di giunzione e poi 9 geni per la regione costante (tanti quanti sono gli isotipi).

Ricombinazione somatica Somatica perché avviene nelle cellule del soma e non nella linea germinale. Gli eventi di ricombinazione che avverranno sono regolati ed innescati da delle proteine specifiche per i linfociti B, ma poi saranno utilizzati soprattutto per “ricucire” il DNA e produrre un DNA che possa essere tradotto, saranno usati dei meccanismi di taglio e unione dei segmenti, normalmente utilizzati dalla cellula. Attraverso la ricombinazione somatica si forma una sequenza di DNA che codifica per la regione variabile, mentre le regioni costanti non sono sottoposti a riarrangiamenti, poiché il segmento C per la regione costante è un gene che può essere trascritto (geni C). Nel genoma ci sono molte copie di segmenti genici, come abbiamo visto, tra i quali avviene una selezionecasuale, per dare variabilità alle regioni variabili. Non tutti i segmenti genici vengono usati con la stessa frequenza, esistono tra questi alcuni segmenti gei ci che non sono funzionali (pseudogeni), e altri che invece che accumunalo mutazioni che fanno aumentare la variabilità. Riarrangiamento somatico e diversità combinatoria Vi è una diversità combinatoria importante tra la catena leggera e la catena pesante: la catena pesante ha le sequenza D che non sono presenti nella catena leggera che ha solo le sequenza V e J. Tra le sequenze V e J avviene la prima ricombinazione somatica, cioè avviene il primo taglio e cucito a livello del DNA germinale in cui una sequenza J si attacca ad una sequenza V. Il DNA viene quindi riarrangiato con i segmenti V e J uniti. Dopo il primo evento di ricombinazione tutto il tratto viene trascritto in un unico RNA. La catena pesante, contenendo la sequenza D, necessita di una prima ricombinazione somatica che avviene legando i segmenti J e De di una seconda ricombinazione somatica per legare la sequenza DJ con la sequenza V ed ottenere un’unica sequenza trascrivibile VDJ. ’importante differenza è quindi che la catena leggere si ottiene con una sola ricombinazione somatica, mentre

quella pesante con due ricombinazioni somatiche, ciò e dovuta alla struttura intrinseca delle sequenze di DNA presenti sulla linea germinale.

Nell’immagine si può anche vedere la struttura della catena pesante di isotipo µ. I 4 box della regione Cµ corrispondono ai 4 domini immunoglobulinici. Quindi il gene è costituito da 4 esoni (ogni esone codifica per un dominio immunoglobulinico) e tutto il gene sarà trascritto indipendentemente dalla regione che ha effettuato ricombinazione somatica e solo dopo che la ricombinazione somatica è terminata. La stessa cosa vale per le sequenze MC che permettono all’immunoglobulina di stare all’interno della membrana (peptidi di membrana) che quindi vengono trascritti anch’essi indipendentemente. N.B.: i segmento sotto ricombinazione somatica sono legati insieme in modo del tutto casuale, questo da una diversità combinatoria, che è legata al numero specifico di segmenti che possiamo combinare e le combinazioni che sono possibili, danno variabilità alle regioni variabili delle immunoglobuline. Per capire quanto è la diversità combinatoria del riarrangiamento somatico casuale, possiamo dire che: • catena leggera umana K: 40 segmenti VK e 5 segmenti JK che possono essere combinati in 200 (40X5) combinazioni; • catena leggera umana λ: 30 segmenti Vλ e 4 segmenti Jλ che possono essere combinati in 120 (30X4) combinazioni; Si possono formare 320 regioni variabili per le catene leggere. • catena pesante umana: 40 segmenti VH, 25 segmenti genici DH e 6 segmenti JH che possono essere combinati in 6000 (40X25X6) combinazioni. Si possono formare 6000 regioni variabili per le catene pesanti. Le 320 regioni variabili delle catene leggere si possono associare alle 6000 regioni variabili delle catene pesanti Potrebbero originare a 1.9X106 (~107) differenti specificità anticorpali. Sequenze segnale di ricombinazione Il processo di ricombinazione è diretto dalle sequenze segnale di ricombinazione (SSR), che fiancheggiano la posizione 3’ del segmento V, le posizioni 5’ e 3’ del segmento D e la posizione 5’ del segmento J; esse forniscono i siti di riconoscimento degli enzimi che tagliano e ricuciono il DNA. Le sequenze SSR sono costituite da due sequenza fisse di 7 e 9 pb (eptamero e nonamero) e da due sequenze spaziatrici che possono essere da 12 o 23 pb. La sequenza segnale di ricombinazione è formata da un eptamero, cioè da 7 basi al 5’, 9 basi al 3’ e due spaziatori in mezzo, uno da 12 basi e uno da 23 basi. Si alternano sempre sequenze che portano uno spaziatore 12 e sequenze che portano lo spaziatore 23 e così via, non si possono mai legare due sequenze con lo stesso

spaziatore. Quindi la ricombinazione genica può avvenire solo tra tipi diversi di SSR.

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Geni della catena λ: V presenta uno spaziatore 23m mentre J presenta uno spaziatore 12, perciò la ricombinazione può avvenire;

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Geni della catena K: V presenta uno spaziatore 12, mentre J presenta uno spaziare 23, perciò la ricombinazione può avvenire.

N.B. nelle catene leggere gli spaziatori sono posizionati in modo diverso, per impedire che avvenga la ricombinazione tra gli spaziatori delle due catene leggere. •

Geni della catena pesante: V presenta una sequenza 23, il segmento D presente al 3’ e al 5’ due sequenze 12, mentre J presenta una sequenza 23. Questo permette la ricombinazione di J con D e poi di D con V.

Le sequenze spaziatrici sono fondamentali per avere una ricombinazione intercromosomica, impedendo quindi la ricombinazione tra sequenze presenti in diversi cromosomi. Giunzione codificante Quali sono i prodotti della ricombinazione e come avviene il meccanismo dal punto di vista molecolare? La ricombinazione somatica, come abbiamo detto prima, permette il taglio e il cucito del DNA, quindi porta alla formazione di una: • giunzione segnale: DNA circolare extracromosomico che viene clivato senza funzionare; • giunzione codificante: è formata dalla ricombinazione tra J e V e permetterà di avere un segmento codificante. La formazione di questa giunzione, è caratterizza dalla formazione di forcine a lato di ciascun segmento di DNA, che attiva il meccanismo di riparazione del DNA non omologo a doppio filamento. Il processo di ricombinazione introduce sostituzioni casuali nella sequenza nucleotidica alle giunzioni codificanti introducendo un alto livello di variabilità giunzionale. Questa diversità non è codificata dal DNA germinale, ma è generata dall’azione sequenziale degli enzimi che riparano il DNA tagliato.

Regola del 12/23 La sequenza SSR è sempre adiacente alle sequenze codificanti V, D e J; di norma la ricombinazione avviene solo tra i segmenti presenti sullo stesso filamento. Un gene fiancheggiato da uno spaziatore di 12pb può essere coniugato solo con uno di 23pb, attraverso una regola nota come 12\23; quindi nella formazione della catena pesante in gene D può legarsia V e a J, ma V non può legarsi a J.

L’orientamento delle sequenze dei segmenti genici all’interno del tratto ricombinante del DNA è importante in quanto a seconda che i segmenti genici abbiano lo stesso orientamento o orientamento diverso, questo può portare alla formazione di una sequenza di giunzione e una di segnale, oppure la sequenza sarà mantenuta internamente e questo potrà dare problemi nelle seconde ricombinazioni.

Orientamento SSR Ci devono essere un 23 ed un 12 che siano orientati nello stesso modo con le V e le J appaiate, perché devono arrivare le proteine che riconoscono gli spaziatori 23 e 12. Se gli spaziatori non sono allineati e le sequenze non sono parallelizzate, non si può avere ricombinazione. Quando si crea questa struttura si crea la giunzione codificante e quindi il segnale di giunzione, cioè il DNA circolare extracromosomico. Potrebbe succedere che le giunzioni si appaiano, ma il DNA non è srotolato e presenta dei ripiegamenti.

Avviene comunque la ricombinazione, ma restano le sequenze ricombinatorie sul DNA cioè rimane la giunzione codificante e non viene fatto il segale di giunzione. Questa attività ricombinatoria causerà l’assenza nella cellula del DNA extracromosmico e quindi la cellula non continuerà il suo cammino verso la proliferazione e la formazione degli anticorpi, quindi la cellula andrà verso apoptosi. Ciò dimostra come il meccanismo sia altamente controllato e infatti è il meccanismo su cui la cellula investe maggiormente per creare il primo check-point cellulare.

Ricombinazione: enzimi Il processo di ricombinazione somatica avviene grazie alla presenza di enzimi linfocitari che tagliano e cuciono il DNA, ovvero le ricombinasi V(D)J, che sono formate da varie proteine specifiche, tra cui un tetramero costituito da RAG1 e RAG2 che sono presenti solo nei linfociti e derivano da geni attivanti la ricombinazione. RAG1 funge da endonucleasi di restrizione, che è in grado di riconoscere una sequenza eptamerica. RAG2 è un cofattore che favorisce l’interazione con altri fattori importanti per la ricombinazione.

Enzimi invece coinvolti per cucire, sono normali meccanismi di riparazione del DNA: il meccanismo di fusione non–omologo di riparazione del DNA (NHEJ) e di riparazione delle rotture a doppio filamento (DSBR). Si legano agli spaziatori. L’imprecisione del DSBR può attivare NHEJ che è cruciale per la diversità giunzionale e l’immunità adattativa. Il complesso RAG si lega agli spaziatori 23 e 12 in modo che le sequenze siano allineate. •

Giunzione segnale: (precisa) la proteina Ku lega le estremità degli spaziatori del DNA che restano tronche, richiama la ligasi IV-XRCCA e si forma un segnale di giunzione preciso dato dagli spaziatori 23-12.

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Giunzione codificante: (impreciso) il DNA è tagliato alle estremità delle sequenze eptameriche con un taglio netto e le estremità del DNA reagiscono formando delle forcine. La proteine Ku richiama la proteina di riparazione del doppio filamento, la proteina chinasi per formare la DNA-PK e la proteina Artemis che ha attività nucleasica per aprire le forcine. La giunzione è riempita da nucleotidi a caso grazie alla terminal deossinucleotidil transferasi (TdT). I due strand vengono uniti dalla Ligasi IV che forma un complesso con XRCC4.

Variabilità giunzionale Un ulteriore aumento della diversità del repertorio delle Ig è dato dalla diversità giunzionale, tale processo introduce nucleotidi a caso nelle giunzioni codificanti. Nucleotidi P→ palindromici Nucleotidi N→ non-template. I nucleotidi P ed N formano la terza regione ipervariabile HV3 codificata dai segmenti VJ per le catene leggere e dal segmento D e dalle sue giunzioni per la catena pesante. La variabilità giunzionale fa aumentare si 3x107 volte la variabilità complessiva.

Diversità ricombinatoria La diversità di un riarrangiamento di segmenti genici per la regione variabile è generata da tre meccanismi: • diversità combinatoria: dovuta al fatto che esistono molte copie diverse fra loro di ogni tipo di segmento genico e posso essere riarrangiati con combinazioni diverse (107). • diversità giunzionale: durante la ricombinazione sono aggiunti i sottratti nucleotidi. Questo genera 1X1011differenti molecole anticorpali. • le regioni variabile delle catene pesanti e leggere possono combinarsi in vari modi quando si appaiono sulle immunoglobuline per formare i siti di legame dell’antigene→ 1011 Cellule B vergini Nel locus della catena pesante riarrangiato, gli esoni codificanti per il peptide leader e per la regione V sono all’estremità 5’ del DNA che codifica per le nove differenti regioni C. Le prime Ig ad essere trascritte sono le IgM e le IgD. Le cellule B vergini esprimono contemporaneamente IgM e IgD sulla loro superficie, questo è possibile grazie ad un evento di splicing alternativo dello stesso trascritto primario. La trascrizione del gene della catena pesante termina a valle del gene Cδ→ splicing alternativo di un trascritto primario → mRNA per catena µe δ.

I geni per la catena pesante Cµ e Cδ sono appena dopo il gene che porta la regione variabile. Quindi si crea un trascritto che porta da L in poi con tutti gli altri geni. Il gene C più vicino alla regione VDJ è il gene Cµ seguito dal gene Cδ: • la trascrizione comincia a monte del peptide leader nel promotore della regione VH e prosegue lungo entrambi i geni Cµ e Cδ; • il trascritto primario e soggetto a splicing, cioè va incontro a taglio, poliadenilazione e riunione rimuovendo l’RNA che non interessa; • si ottengono due mRNA.

Vediamo dove si formano le varie regioni rispetto alle proteine Sulla catena leggera, come possiamo vedere, avviene la prima ricombinazione somatica che permette di mettere insieme il segmento V e J. Nel momento in cui avviene la trascrizione, in questo caso il segmento J si porterà dietro anche C, quindi nel momento in cui avverrà la trascrizione, il trascritto di RNA, conterrà al suo interno L, VJ e C. il trascritto di RNA poi andrà in contro ad un processo di splicing che porterà alla formazione di una molecola di mRNA, la quale verrà poi tradotta in una catena polipeptidica. Nel momento in cui avviene il ripiegamento della proteina, il segmento J, si andrà a localizzare nella regione al di sotto del segmento V, il quale sarà invece localizzato nella parte esterna della regione variabile, invece il segmento C occupata tutta la regione costante. Il frammento J rappresenta il frammento di interfaccia tra la parte variabile della catena leggera e di quella pesante. Nella catena pesante avviene una prima ricombinazione tra J e D, formando il frammento DJ, che rappresenta il sito maggiore di ipermutazione. Questo frammento poi va in contro ad un'altra ricombinazione, permettendoli di legarsi al segmento V, formando il frammento VDJ. Una volta che sono avvenute entrambe le ricombinazioni somatiche, si forma un primo trascritto di RNA, che si porta dietro L, VDJ e i geni C selezionati, il quale poi andrà in contro ad un processo di splicing, portando allaformazione di un mRNA, che poi andrà in contro a traduzione, portando alla formazione di una catena pesante. Essa presenterà nella sua parte variabile da J e D, nella interfaccia con la catena leggera; quindi, la catena leggere e quella pesante hanno come interfaccia J e D. Il frammento V invece si trova nella parte esterna, mentre tutte le regioni costanti saranno occupatedai frammenti C.

Forma di membrana e forma secreta Tutte le classi di immunoglobuline possono presentarsi in due forme: una di membrana e una secreta, l’anticorpo. Le cellule B esprimono inizialmente la forma trasmembrana delle IgM; dopo stimolazione con l’antigene alcune di esse si differenziano e producono la forma secreta; la forma trasmembrana possiede un dominio idrofobo di circa 25 aa nella porzione carbossi-terminale con cui si ancora alla membrana che non è presente nella forma secretoria che termina invece con una coda idrofila; Le due differenti porzioni carbossi-terminale delle forme transmembrana e secretoria, sono codificate da due esoni differenti e la produzione delle due forme è dovuta a splicing alternativo: inparticolare, i due esoni delle igM, sono detti M1 e M2, che codificano per i 25 amminoacidi della porzione idrofobica carbossi terminale della forma trans membrana e questi due esoni sono fiancheggiati da due siti di poliadenilazione a partire dai quali, sarà possibile ottenere la forma secretoria o quella transmembrana. Le forme trasmembrana e secreta derivano da un processo di splicing alternativo dello stesso gene della catena pesante. • •

Forma secreta: l’estremità carbossi-terminale è codificata dall’esone che codifica per il quarto dominio immunoglobulinico con il fonde il SC (Secretion coding); Forma di superficie: l’estremità carbossi-terminale è codificata da due distinti piccoli esoni a valle (membrane coding MC).

Esclusione allelica Durante la maturazione della cellula B, il processo di riarrangiamento dei geni immunoglobulinici è strettamente controllato, cosicché alla fine solo una catena H e una L siano espresse. Questo feno...