7- metabolismo respiro fermentativo dei lieviti PDF

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7- METABOLISMO RESPIRO-FERMENTATIVO NEI LIEVITI Regolazione del metabolismo dei lievit S.cerevisiae è il più studiato ha delle caratteristche peculiari per quanto riguarda il sistema di trasporto, riguardo le varie proteine di trasporto, che sono un sistema di adattamento di questo lievito alle varie condizioni ambientali che incontra nei vari ambient in cui può essere presente. Sicuramente il suo adattamento è quello a substrat con elevate concentrazioni di zuccheri in quanto è stato “addomestcato” per fermentare liquidi (come succhi di frutti o estratti che derivano dall’idrolisi dell’amido tramite enzimi endogeni del substrato stesso, del seme come grano orzo masi.. o enzimi microbici di alcuni lievit che hanno attività amilasica). In ogni caso in quest ambient ricchi di zuccheri l’adattamento del lievito consiste nell’elevata velocità di utlizzare lo zucchero, in questo modo lo sottrae ai compettor. La fermentazione è la via metabolica che consuma più velocemente lo zucchero, rispetto alla respirazione. Quindi in condizioni di anaerobiosi il lievito consuma più velocemente lo zucchero. Però la prevalenza di fermentazione determina anche una minor produzione di ATP, quindi consuma velocemente lo zucchero ma produce poca ATP. Altra cosa impo è che avendo questa preferenza per la feermentazione abbiamo anche un basso rapporto ATP/O2, cioè per ogni mole di O2 si produce meno ATP, rispetto ad altri organismi. Elenchiamo 4 tpologie di regolazione: • “Effetto Pasteur” inibizione della fermentazione da parte dell’ossigeno (la via respiratoria inibisce la via fermentatva). Cioè se c’è ossigeno il lievito tende a respirare. • “Effetto Crabtree” inibizione della respirazione in aerobiosi ad alte conc. zuccherine (fermentazione in aerobiosi). O2 + elevate concentrazioni zuccherine= fermentazione. (condizione molto comune nelle prime fasi delle fermentazioni nel mosto) • “Effetto Kluyver” (“cluviè”) no fermentazione di alcuni zuccheri (disaccaridi) solo assimilat (fermantono solo glucosio, gli esosi) in condizioni di anaerobiosi. • “Effetto Custers” effetto stmolante dell’ossigeno sulla attività fermentatva. Definito anche “contro effetto pasteur”, perché mentre l’effetto pasteur tende a inibire la fermentazione, in questo caso una certa quanttà di ossigeno tende a favorirla, funge da stmolate.

METABOLISMO FERMENTATIVO NEI LIEVITI: regolazione. • Condizioni di anaerobiosi I lievit anaerobi facoltatvi tendono a crescere anche in assenza di ossigeno. Per S.cerevisiae l’unico elemento che limita la crescita sono alcuni component cellulari: Se l’ossigeno manca del tutto la fermentazione non funziona benissimo, specialmente per S.cerevisiae perché alcuni component della cellula, specialmente quelli legat alla composizione della membrana citoplasmatca come ergosterolo e acidi grassi, vengono sintetzzat attraverso una via metabolica che prevede l’utlizzo di ossigeno. Quindi l’integrità della membrana citoplasmatca dipende dalla presenza di ossigeno (abbiamo visto che l’etanolo penetra passivamente), mentre quest component mantengono l’integrità quindi in condizioni di anaerobiosi devono essere aggiunt al terreno. Altre specie di lievit anaerobi facoltatvi come Brettanomyces spp e C.stellata hanno crescita limitata. Lievit aerobi non crescono, per tutti i lievit non fermentatvi c’è assenza di crescita. • Condizioni di aerobiosi In alcuni lievit si può avere l’ “effetto Pasteur” velocità di fermentazione ridotta rispetto all’anaerobiosi (esempio: Candida tropicalis che è un lievito fermentante che però in presenza di ossigeno la velocità di fermentazione viene ridotta. vel. di ferm. 40 volte inferiore) in altri lievit possiamo avere l’ “effetto Custers che produce una stmolazione della fermentazione dovuta alla presenza di ossigeno. È il caso di Brettanomyces che generalmente respirano ma in presenza di ossigeno, anche in basse concentrazioni, è favorita la fermentazione. Oppure si può avere l’ “Effetto Crabtree” (S. cerevisiae). EFFETTO CUSTERS IN BRETTANOMYCES

Abbiamo detto che è un effetto per il quale il lievito passando da condizioni di anaerobiosi a condizioni di aerobiosi, tende a migliorare l’attività fermentatva. Questo è spiegato attraverso le vie fermentatve che riguardano la produzione di etanolo. Sappiamo che la via fermentatva classica (di gay lussac) porta alla produzione di etanolo e CO2 dalla decarbossilazione di piruvato. Quando però si producono altri compost, come il caso dei brettanomyces che tendono a produrre acido acetco tramite l’enzima acetaldeide deidrogenasi che tende ad ossidare l’acetaldeide invece di ridurla. L’acido acetco va a ridurre il NAD+ e questo porta a produrre meno etanolo e la fermentazione va lenta. In teoria anche se si produce acido acetco si potrebbe rigenerare il NAD tramite una via metabolica che però è assente in questo lievito. Questo fa si che in condizioni di assenza di ossigeno la fermentazione vada lenta. Si produce un po' di acido acetco, un po' di etanolo ma la fermentazione va lenta. Se c’è ossigeno invece la rigenerazione di NAD può avvenire tramite altre vie e quindi la fermentazione può avvenire più velocemente. Si vede anche sperimentalmente appena vengono instaurate le condizioni di aerobiosi aumenta la produzione di etanolo. I brettanomyces nel vino sono considerat compost indesiderat ma nella birra invece sono important nel caso delle birre acide (appunto producono acido acetco che acidifica il prodotto). EFFETTO CRABTREE È tpico di S.cerevisiae ed è impo per alcune applicazioni: S.cerevisiae è quello che tende a predominare le fermentazioni alcoliche in quanto resiste molto bene alle condizioni che predominano nelle fermentazioni normalmente (quelle italiane almeno perché non è l’unico ma normalmente è quello dominante). Questo effetto non è stato scoperto nelle bevande fermentate ma è stato visto nelle cellule tumorali e in seguito è stato visto anche nei lievit. Abbiamo detto che questo effetto indica una diminuzione della respirazione quando la concentrazione di zuccheri è oltre una certa soglia e in condizioni di aerobiosi. Quindi in condizioni di basse concentrazioni di zuccheri e anaerobiosi il lievito respira; se si supera questa soglia invece tende a feremntare anche se c’è presenza di ossigeno. Quando inizia a fermentare si nota: produzione di etanolo, minor rendimento in biomassa e minore velocità di consumo specifica di ossigeno (è inibita la respirazione quindi usa meno ossigeno). Inoltre l’effetto Carbtree può essere distnto in: • effetto Crabtree a breve termine - istantanea fermentazione alcolica - riduzione del consumo di O2 - minor rendimento in biomassa • effetto Crabtree a lungo termine (è quello che c’è durante la fase di adattamento) consumo di ossigeno cambia (ma minor resa energetca P/O) [Quello che cambia è il consumo di ossigeno che tende ad essere ripristnato, anche se con minor resa di ATP]. Il microrganismo, quindi, si adatta e ricomincia a consumare ossigeno ma con una bassa resa in ATP. Quindi si può dire che la catena respiratoria sia meno redditzia. - minor rendimento in biomassa **MECCANISMI DI CONTROLLO DELL’EFFETTO CRABTREE Possiamo pilotare questa attività e possiamo rilevarlo in condizioni di aerobiosi quando abbiamo basse concentrazioni di zuccheri. Possiamo rilevare questo effetto sia in condizioni di basse concentrazioni zuccherine, quinid viene utlizzato un sistema di coltura fed batch oppure un sistema di coltura contnua (vedremo più avant comunque abbiamo un flusso contnuo di nutrient e prodotti catabolici facendo si che instauri un equilibrio e questo equilibrio è mantenuto al di sotto della soglia, si mantene un livello basso di zuccheri). Se aumeta il flusso, aumenta la concentrazione zuccherina e il lievito inizia il processo fermentatvo. L’effetto viene regolato, a parità di condizioni di ossigenazione, dalla concentrazione zuccherina. C’è un flusso glicolitco, quando c’è molto zuccher all’esterno tende ad essere trasportato molto all’interno in quanto le permeasi sono attivate a seconda della concentrazione. Tutto il flusso glicolitco da quando il glucosio entra fino al piruvato, dipende dalla concentrazione. Più zucchero c’è, maggiore è il consumo di ossigeno.

A livello di piruvato avviene lo shift tra fermentazione e respirazione. Da una parte abbiamo la piruvato decarbossilasi (via fermentatva, ha maggior velocità di consumo dell’ossigeno), dall’altro lato abbiamo la piruvico deidrogenasi (da orgine all’acetl coenzimaA e la via respiratoria). Al di sotto della soglia della concentrazione zuccherina, il flusso è più basso, la concentrazione di piruvato è più bassa ed è attiva la respirazione perché se c’è poco zucchero il mco tende ad utlizzarlo nel miglior modo possibile e quindi a ottenere più ATP, è inutle utlizzarlo velocemente. Quando si supera la soglia, si attiva anche l’enzima a bassa affinità ovvero la piruvato decarbossilasi quindi si attiva la via fermentatva, viene prodotto etanolo e lo zucchero viene consumato più velocemente. Vengono attivate entrambe, tuttavia quando si instaura la via fermentatva vengono inibit gli enzimi della via respiratva, quelli citocromici (nella catena respiratoria dei mitocondri). Il glucosio da una parte favorisce la via fermentatva attivando la piruvato decarbossilasi e dall’altro sfavorisce la via respiratoria inibendo gli enzimi citocromici. Nell’effetto Crabtree a lungo termine questa regolazione di inibizione avviene ma c’è un adattamento: il lievito ricomincia a consumare ossigeno però attraverso vie metaboliche meno redditzie, cioè con minor produzione di ATP. Questo si valuta tutto attraverso il rapporto ATP prodotto/ossigeno consumato. (rapporto P/O). Questa regolazione è impo in S. cerevisiae percjè dal punto di vista biotecnologico interessa sia la produzione di biomassa (e quindi la produzione di ATP che comporta quindi produzione di biomassa), sia l’utlizzazione del processo fermentatvo. Cambiano le necessità in funzione dello scopo. Quindi se si vuole produrre biomassa a livello industriale (per produrre lievito da usare ad es nell’industria panaria per la produzione di CO2 o effetto probiotco o altre applicazioni in cui serve il lievito) è impo il processo respiratorio, dunque si tende a ridurre a zero il processo fermentatvo e si fa, ad esempio, attraverso dei sistemi di alimentazione contnua per avere concentrazione zuccherina vicina a quella limite. Se si vuole l’attività fermentatva per produzione di etanolo si impostano condizioni di anaerobiosi. DUNQUE all’interno dei lievit anaerobi fermentatvi possiamo distnguere: • CRABTREE POSITIVI Hanno attività simile a S.cerevisiae. potremmo chiamarli aerobi fermentatvi perché prediligono l’attività fermentatva. alta velocità specifica del consumo degli zuccheri basso rendimento in biomassa rapporto P/O uguale ad 1. S. cerevisiae, Schiz. pombe, Brettanomyces • CRABTREE NEGATIVI Hanno capacità fermentatva ma prediligono la fermentazione. bassa velocità specifica del consumo degli zuccheri alto rendimento in biomassa rapporto P/O superiore ad 1 Possono fermentare in condizioni partcolari come basse conentrazioni di ossigeno. Poi la prevalenza di specie di lievito dipende anche dal tpo di substrato, condizioni ambientali come temperatura e pH o alcuni compost peculiari con attività antmicrobica. Cioè ci sono una serie di fattori ambientali che possono determinare la prevalenza di una specie piuttosto che un’altra però comunque questa regolazione dell’effetto crabtree contribuisce a determinare le specie dominant in un determinato processo fermentatvo e quindi li possiamo distnguere in C.positvi e C.negatvi. Quindi si può definire una repressione catabolica da glucosio: glucosio o un suo prodotto iniziale tende a reprimere la sintesi di alcuni enzimi respiratori (repressione genica o no ulteriore sintesi) oppure inattivazione catabolica che è più rapida. Il glucosio tende a distruggere tramite proteolisi vacuolare gli enzimi respiratori....