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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA ÁREA DE BACTERIOLOGÍA

Nombre: Edison Hernández

Fecha: 12/11/2017

Eduardo López Paralelo: “A” Fecha: 17/05/2017 Tema: Pruebas bioquímicas: DECARBOXILASAS y Medio SIM Introducción Las pruebas bioquímicas son una serie de análisis cuyo objetivo es determinar la actividad metabólica de una cepa pura de microorganismos, estos análisis se basan en las distintas reacciones que puedan producir los microorganismos. Así tenemos que las bacterias por ejemplo pueden son identificadas por la capacidad de fermentar azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de compuestos, la producción de compuestos coloreados, etc. Existen varios tipos de pruebas químicas: Catalasa, Citrato, Fenilalanina desaminasa, Indol, Lactosa, Manitol, Movilidad y Nitratos, Oxidasa, Rojo de Metilo y Voges-Proskauer, Ureasa, Descarboxilasa(Molina, 2008) (UNAM, n.d.). Descarboxilasas La descarboxilación es un proceso en el cual las descarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminoácidos, formando la correspondiente amina. Los tres aminoácidos que se ensayan en la identificación de enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La descarboxilación de lisina y ornitina da cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que la descarboxilación de arginina da citrulina por acción de una dehidrolasa. Esta prueba se debe realizar con un tubo control que contiene el medio base sin aminoácido. Como la descarboxilación es una reacción anaeróbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estéril. El proceso se produce en dos etapas: por fermentación de la glucosa se produce una acidificación del medio (pH < 6,0), apareciendo color amarillo. La acidificación es necesaria para que ocurra la descarboxilación. Este último proceso da lugar a la formación de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador a color

violeta. Esta prueba se utiliza tanto en la identificación de bacilos gramnegativos como de bacilos y cocos grampositivos (Cercenado et al., n.d.). Agar de hierro y lisina (LIA) Algunos microorganismos son capaces de provocar la descarboxilación de los aminoácidos por inducción de enzimas específicas, el resultado de esta descarboxilación es la producción de una amina (o diamina) y dióxido de carbono. Tal es el caso de la producción de la enzima lisina descarboxilasa la cual al actuar sobre la lisina produce una diamina llamada cadaverina. Tabla 1. Componentes del medio. Fórmula (en gramos por litro) Peptona de gelatina 5.0 Extracto de levadura 3.0 Glucosa 1.0 Lisina 10.0 Citrato de hierro y amonio 0.5 Tiosulfato de sodio Púrpura de bromocresol Agar

0.04 0.02

Instrucciones Suspender 35 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolución completa. Distribuir y esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la punción.

15.0 pH final: 6.7 ± 0.2

Fundamento En el medio LIA se puede detectar la producción de la lisina descarboxilasa ya que se produce una reacción coloreada por un cambio en el pH del medio, que contiene como indicador púrpura de bromocresol. Un cambio del color original del medio (morado) hacia amarillo en el fondo indica una reacción ácida por la fermentación de una pequeña cantidad de glucosa en el medio. Si el microorganismo produce lisina descarboxilasa, la acción de esta enzima sobre la lisina dará lugar a la cadaverina, la cual provocará un cambio de pH hacia la alcalinidad dando un color morado que sobrepasa la acidez debida a la glucosa. Así pues, un fondo amarillo indica que no se produce lisina descarboxilasa y un color morado que si es producida (Mac Faddin, Rondinone, & Giovanniello, 2003). Procedimiento •

Siembra: se realiza por punción profunda con aguja de inoculación.

•

Incubación: En aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 °C.

Resultados 1. Decarboxilación de la lisina: • Prueba Positiva: Pico violeta y fondo violeta. • Prueba Negativa: Pico violeta y fondo amarillo. 2. Desaminación de la lisina: •

Pico rojizo y fondo amarillo.

3. Producción de ácido sulfhídrico: •

Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio especialmente en el límite del pico y fondo.

(Britinialab, n.d.) Tabla 2. Ejemplos de microorganismos y sus resultados. Microorganismos

Color en el pico de flauta Rojo

Color en la base del tubo Amarillo

Ennegrecimiento del medio Negativo

Salmonella typhimurium Salmonella enteritidis Providencia spp.

Púrpura

Púrpura

Positivo

Púrpura

Púrpura

Positivo

Rojo

Amarillo

Negativo

Citrobacter freundii

Púrpura

Amarillo

Positivo

Morganella spp.*

Rojo

Amarillo

Positivo

Edwarsiella spp.

Púrpura

Púrpura

Positivo

Klebsiella pneumoniae Escherichia coli

Púrpura

Púrpura

Negativo

Púrpura

Púrpura

Negativo

Proteus mirabilis

SIM Medio Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae. Fundamento El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2 (Britinialab, n.d.). Tabla 3: Componentes del medio. Fórmula (en gramos por litro) Tripteína Peptona Sulfato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Agar

20.0 6.1 0.2 0.2 3.5

Instrucciones Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver; calentar agitando y hervir durante un minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemólisis y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Solidificar en posición vertical.

pH final: 7.3 ± 0.2

Siembra A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con aguja de inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se realice en línea recta. Incubación Durante 24 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis. Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich. Resultados: Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende más allá de la línea de siembra. Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra.

Cepas Móviles

Cepas inmóviles

Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio. Cepas SH 2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.

Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich. Cepas indol negativas: sin cambio de color.

Tabla 4: Ejemplos de microorganismos y sus resultados. Microorganismo

Movilidad

Indol

Producción sulfhídrico

E. coli K. pneumoniae P. mirabilis S. typhimurium S. enteritidis S. flexneri

+ + + + -

+ -

+ + + -

de ácido

Limitaciones En las bacterias aerobias estrictas, que sólo crecen en superficie, la movilidad puede ser difícil de observar. Algunas bacterias productoras de melanina como M. morganii, pueden dar un color parduzco, que no debe confundirse con el color negro debido a la producción de ácido sulfhídrico (“PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS,” 2009). Medio preparado: color ámbar. Resumen El LIA (Agar Hierro Lisina) en un medio solido cuyo fundamento se basa en la presencia de la enzima lisina descarboxilasa, este método sirve para identificar principalmente enterobacterias. El SIM medio es semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo y es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Preguntas En la presencia de que enzima se basa el Agar LIA a) Ornitina descarboxilasa b) Arginina Descarboxilasa c) Lisina Descarboxilasa d) Todas e) Ninguna ¿Cuáles son los aminoacidos paraq identificacion de enterobacterias? a. Arginina, Leucina, Ornitina b. Arginina, Lisina, Ornitina c. Ornitina, Alanina,Lisina d. Todas e. Ninguna ¿Qué permite determinar un medio SIM ? a. Motilidad b. Producción de indol c. Ninguna d. Todas e. Producción de Ac. Sulfúrico ¿Cuál es la principal característica de las cepas indol positivas? a) b) c) d) e)

Desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich. El medio permanece sin cambio de color. Producen turbidez del medio Ninguna Todas

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Bibliografía Britinialab. (n.d.). Lisina Hierro Agar. Retrieved November 12, 2017, from http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/lisinahierroagar.htm Cercenado, E., Cantón, R., Bou, G., Autores, A., Fernández, A., Celia, O., … Ramos, V. (n.d.). Procedimientos en Microbiología Clínica. Retrieved from https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia /seimc-procedimientomicrobiologia37.pdf Mac Faddin, J. F., Rondinone, S., & Giovanniello, O. (2003). Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. Mdica Panamericana. Molina, A. (2008). MICROBIOLOGIA: PRUEBAS BIOQUIMICAS. Retrieved November 12, 2017, from http://medicinavunimagdalena.blogspot.com/2008/03/pruebasbioquimicas.html PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS. (2009). Retrieved from https://microdonto.files.wordpress.com/2009/04/pruebasbioquimicas.pdf UNAM. (n.d.). Uso de Pruebas Bioquímicas y Técnicas Rápidas para la Caracterización Fisiológica de Bacterias. Retrieved from http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Practica6.2PruebasBioquimicas_21633.p df...