8. lezione 19-10-17 (lab) Primer Blast PDF

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8° lezione bioinformatica (19-10-17) Andare su NCBI-BLAST-Primer BLAST.

Come vediamo in figura, troveremo una casella dover poter inserire la nostra sequenza, poi in “Range” possiamo invece inserire da dove deve partire e dove deve finire il primer FOWARD, ma anche il primer REVERSE.

In “Primer Parameters” invece da la possibilità di inserire sequenze di primer, cioè noi potremmo avere un primer foward e vogliamo cercare il reverse ( inserendo il foward il programma ci troverà il reverse). Oppure possiamo inserire entrambi i primer vogliamo solo provare i nostri primer nel programma per vedere che caratteristiche ci da sul nostro primer. Poi troveremo “PCR product size” che serve per specificare la dimensione del prodotto di PCR. Nel prodotto di PCR sono compresi anche i primer, perché i primer durante la procedura di PCR vengono inglobati e la polimerasi utilizza i primer come innesco per poi allungare il filamento ( prendendo il filamento stampo e creando un nuovo filamento ). Quando io poi voglio fare la sequenza nucleotidica, il primer viene sequenziato ma in realtà non fa parte della sequenza perché lo abbiamo aggiunto noi e quindi quando faccio la sequenza devo andare a eliminare i primer. Fare un amplificato, sequenziare e lasciare il primer nella sequenza e depositarlo nelle banche dati è un grave errore! Poi abbiamo “ # of primers to return “ ovvero numero di primer che devono tornare, quante coppie di primer voglio che il programma mi trovi. “Primer melting temperatures” ovvero la “temperatura di Melting”, ovvero la temperatura alla quale metà della molecola di DNA è dissociata. Sarebbe la temperatura alla quale il primer non è più in grado di legarsi al filamento stampo. Più alta è meglo è. Nella figura di cui sopra vediamo come viene indicato un Range di possibili valori minimi e massimi, che di default va da 57 a 63 °C, con una temperatura ottimale di 60 °C. Importantissima è la differenza di temperatura tra i due primer, che deve essere al massimo di 3 gradi.

Invece questi parametri permettono di progettare primer a cavallo di esoni e introni, però per poter utilizzare questi parametri, nella sequenza ci deve essere già l’informazione di quali sono gli esoni e quali sono gli introni. Il programma utilizza in realtà per progettare i primer un programma che si chiama “PRIMER 3”, lo troviamo qui su blast perché oltre a trovare i primer, primer blast va a cercare se i primer che progetta possono funzionare anche su altre sequenze ( per farlo usa blast ). Cosa importante è disabilitare la funzione “Enable search for primer pairs specific to the intended PCR template”. Lo facciamo perché questo tipo di ricerca richiede tempo.

Aprendo i parametri avanzati, troviamo questo gruppo di parametri relativo alla ricerca fatta con blast ( ad esempio la dimensione della parola – Blast word size ).

Per quanto riguarda invece i parametri avanzati riguardante i primer, vediamo alcuni parametri interessanti come: - Primer Size, ovvero quanto è grande il primer. Normalmente è di 20 nucleotidi ma si può impostare tra 15 e 25 nucleotidi, con un optimum di 20 nucleotidi. - Primer GC content (%), ovvero percentuale di CG. Anche se il programma lo imposta di default tra 20 e 80, ottimalmente dovrebbe andare tra 40 e 60. Quantità di CG e lunghezza del primer determinano la temperatura di Melting dei primer. - Max Poly-X, indica la ripetizione di una determinata base. E’ meglio evitare in un primer ripetizioni della stessa base. In questo caso di default è permessa la ripetizione di 5 volte della stessa base. Se lo imposti a “1” non otterrai primer. - Max 3’ Stability, relativo alla stabilità del 3’. - Max GC in primer 3’ end, ovvero la percentuale di CG che deve essere presente al 3’. Per regione 3’ il programma intende gli ultimi 5 nucleotidi. Tutti questi parametri indica la possibilità che il primer forma una struttura secondaria, ad esempio un anello, e che quindi potrebbe creare dei problemi nella reazione.

Questo gruppo finale di parametri invece è relativo al calcolo della temperatura di melting.

Infine troviamo questi parametri relativi agli oligo. Ricordarsi che questo software non serve solo per progettare primer ma anche per progettare sonde oligonucleotidiche. Le regole relative ai primer vanno bene anche per le sonde. Quindi se uno vuole progettare una sonda, ci sono dei parametri che permettono di regolare la dimensione della sonda, la sua temperatura di melting e anche la percentuale di CG. Per le sonde non è importante la regione 3’. A questo punto lanciamo il programma inserendo questo codice : “FN825819”.

Nella pagina che otterrai troverai questo grafico che ti permette di vedere come sono allineati le coppie di primer , in particolare i “triangolini” rappresentano i primer. Quindi con questo grafico andiamo a vedere dove si vanno a posizionare i primer.

In quest’altra immagine invece possiamo vedere le informazioni relative ai vari primer, come ad esempio:  la sequenza ( in direzione 5’-3’ );  la lunghezza dei primer;  il sito di inizio e di fine dove si trova il primer;  temperatura di melting;  percentuale di CG%;  Self complementarity ( complementarietà del primer con se stesso ), i numeri indicati rappresentano residui del primer che possono formare dei legami con se stesso. Più il numero è elevato peggio è. ( al massimo deve essere 6, l’ideale è intorno a 0-2 ).  Self 3’ complementarity ( se il 3’ forma un legame non dovuto è anche peggio perché li si va a legare la polimerasi ), in questo caso i numeri sono più bassi perché il 3’ è una regione più piccola. L’ideale sarebbe “0”. Per quanto riguarda la complementarietà io potrei anche fare una PCR con “8” di Self complementarity, ma se io la PCR la faccio a una temperatura elevata allora quei 8 nucleotidi non sono sufficienti a stabilizzare quei legami e quindi non mi crea problemi. ESERCIZIO: creare una coppia di primer, con un amplificato che è tra i 200-300 nucleotidi. Il parametro “ PCR product size “ deve avere un range che va da ( 200 a 300 nucleotidi ) . La “ Temperatura di Melting “ più la impostiamo elevata , più i legami sono specifici ed elimino cosi il problema dei primer aspecifici.

Nel nostro caso abbiamo impostato i seguenti parametri.

PCR product size : 200-300 Primer size : Min 15 Opt 20 Max 23 Primer CG % 40-60 Max Poly-X ( 2 ) Max 3’ Stability ( 10 ) Max CG in primer 3’ end ( 5 ) Max Self Complementary Max Pair Complementary

ANY

( 6.00 )

3’

ANY

( 6.00 )

3’

( 2.00 )

( 2.00 )

Nella scelta delle sequenze, non bisogna scegliere quelle in cui alla fine ci sono delle ripetizioni , tipo il “ Primer pair 2 , reverse “ dove trovi delle ripetizioni all’estremità 3’ ( TT ) . Nella scelta bisogna ricordarsi di prendere ad esempio quelle in cui il contenuto di CG è abbastanza elevato , perchè il legami CG sono più forti rispetto ai legami AT e quindi ciò significa che il primer sarà più specifico.

Secondo Esercizio Prendere il codice “AJ534980” e inserirlo nella barra di ricerca di NCBI selezionando il database “Nucleotide” . Si tratta del gene “Pecten maximus 18S rRNA”.

Come vediamo da questa figura, sono presenti le ITS1 e ITS2. I geni ribosomiali sono dei geni ripetuti che formano dei cluster. Non vengono trascritti singolarmente ma vengono trascritti tutti insieme. Quindi abbiamo questo Cluster formato dal 18S, 5.8S e 28S. I tre geni sono separati dalle sequenze spaziatrici, le ITS che sono comunque trascritte perché il cluster viene trascritto tutto insieme. Quindi avviene una specie di splicing ( non si tratta di un vero splicing ) che porta alla frammentazione degli RNA ribosomiali. Nella pagina che si apre quindi del GenBank sono indicati i vari punti di inizio e fine dei frammenti.

Come si vede dalla figura precedente, il primo pezzo va da 1-33 e rappresenta il 18S. Ma il 18S è lungo in realtà 1800 nucleotidi, quindi quel 33 nucleotidi è soltanto l’estremità finale del gene. Poi troviamo la sequenza di ITS1. Successivamente troviamo il 5.8S che è completo perché si trova in mezzo. Poi abbiamo la sequenza di ITS2 e infine per quanto riguarda il 28S vediamo che va da 746-766 nucleotidi ( è rappresentata soltanto la parte terminale ). Il 18S e il 28S sono presenti parzialmente per i primer, che li hanno trovati nel 18S e nel 28S perché dato che sono presenti le ITS se andavo a fare la PCR dovevamo togliere i primer e quindi i primer si devono trovare all’esterno dell’ITS. Ma c’è anche un’altra ragione, perché magari l’interesse era riguardante il 5.8S. Quindi mentre le ITS sono regioni variabili, il 5.8S, il 18S e il 28S sono più conservate tra le varie specie. Se io voglio amplificare il 18S esistono dei primer universali, ovvero dei primer che funzionano su tutti gli organismi, perché sono progettate sulle porzioni più conservate del 18S. Il 16S mitocondriale è un gene che a differenza del 18S, anche se è possibile creare dei primer universali per questo gene ( 16S ) il pezzettino che si amplifica con questi primer universali è piccolo. Quindi non è possibile avere dei primer universali per il 16S che permettano di amplificarlo tutto ( in totale è di 1600 nucleotidi ), ma ci sono dei primer universali del 16S per 500 nucleotidi. Se io voglio amplificare il 5.8S intero con dei primer universali perché magari non conosco l’organismo, non posso utilizzare le ITS perché esse sono regioni molto variabili. Proprio perché sono delle sequenze spaziatrici a livello di queste regioni si accumulano molte mutazioni. Infatti le regioni ITS proprio per questo motivo sono utilizzati per fare studi di popolazione. Se io voglio fare uno studio di popolazione su individui della stessa specie, il 18S-16S sono identici, mentre le ITS possono variare. Per amplificare il 5.8S utilizzando primer universali non li posso concepire all’interno delle regioni ITS e quindi vado a farli in regioni molto più conservate come il 18S e il 28S. Quindi il SECONDO ESERCIZIO consiste nel progettare una coppia di primer con PRIMER BLAST che amplifichi tutto il gene 5.8S il cui amplificato sia piu piccolo possibile, i primer possono essere compresi nella regione ITS. Per farlo andare su NCBI-BLAST-PRIMER BLAST e inserire il codice “ AJ534980”. Cambiare parametri:  Foward Primer;  Reverse Primer;  PCR product size;  Primer GC content (%).  Ricordarsi di togliere la spunta su “Specificity check”. Nel nostro caso abbiamo impostato i seguenti parametri: - Foward Primer ( From 250 To 310 ); - Reverse Primer ( From 466 To 510 ); - PCR product size ( 200-250 ) ; - Primer GC content ( 20-80 ) , in questo caso non abbiamo impostato 40-60% perché come minimo i primer partivano da una percentuale CG intorno al 61%.

Questo rappresentato in figura dovrebbe essere in teoria il miglior primer ottenuto con l’esercizio. Possibili Soluzioni: 1. Prima di tutto i primer per poter amplificare il gene devono stare all’esterno del gene stesso, infatti se io prendevo il primer all’interno della regione del 5,8S non avrei ottenuto tutto il gene. Nel nostro caso caso il gene iniziava da 310, e quindi il primer Foward doveva essere prima del 310. Il gene finiva invece a 466, quindi il Reverse doveva essere dopo il 466. Se io non cambio il range dei primer, il programma effettivamente mi trova dei primer che amplifica tutto il gene ma potrebbe essere un po' lontano dall’inizio del gene, quindi l’amplificato non è il più piccolo possibile. Perciò dovevamo impostare per il FOWARD un range tra 250 e 310, mentre per il reverse da 466 a 510.

2. Lasciare le caselle dei range dei primer con questi parametri ( Foward To 310 e Reverse From 466) invariati e vado a lavorare sulla dimensione dell’amplificato. Io ad esempio so che il gene 5.8S ha una dimensione di 156 nucleotidi, e vado a dire il programma che quel prodotto di PCR deve essere 200-250. Per forza di cose il programma cercherà dei primer vicini al 5.8S perché l’amplificato deve essere piccolo. Quindi il nostro primer che poi andiamo a scegliere deve avere le seguenti caratteristiche: amplificato il più piccolo possibile, percentuale di CG% che si avvicinano maggiormente al range 40-60%, mancanza di ripetizioni a livello della porzione 3’. Infine deve amplificare ovviamente tutto il gene 5.8S che è compreso nella posizione 310-466. Giusto a scopo illustrativo, rifaccio la scelta dei primer ma questa volta lasciando la spunta su “Specificity Check. Quindi il programma deve cercare la sequenza dei primer che trovera in un database, come NR ( che è quello generico ). Inoltre imposto come “Organism” , la specie “Mollusca”.

In questo modo il programma farà una ricerca nel database relativo ai Molluschi. Vado a fare una ricerca di questo tipo principalmente per due motivi: - Ho intenzione di progettare una coppia di primer universali e voglio vedere se effettivamente funzionano anche su altri organismi; - Voglio progettare dei primer che siano specifici per un organismo o per un gene di un organismo e voglio vedere se vengono prodotti degli aspecifici. Ad esempio voglio amplificare il gene dell’insulina nell’uomo, progetto dei primer però voglio essere sicuro che mi amplifichi solo il gene dell’insulina, quindi faccio la ricerca nel database dell’uomo per vedere se quei primer funzionano anche su altre sequenze; se funzionano anche su altri geni non va bene.

In questo caso comparirà questa schermata perché lui riconosce che nel database ci sono delle sequenze identiche a quella che noi abbiamo fornito e ci chiede se vogliamo limitare la ricerca a queste sequenze. Noi mettiamo di no, ovvero non mettiamo le spunte e mettiamo “ Submit”. Se avessimo messo le spunte lui mi andava a cercare i primer relativi a queste sequenze. Quindi il per quanto riguarda il gene dell’insulina farò questo tipo di ricerca e mi darà ulteriori risultati. Se sono relativi solo all’insulina va bene, se amplifica anche altri geni non va bene e quindi devo progettare primer diversi. Oppure io voglio studiare il DNA di un organismo che possiede anche dei parassiti e voglio essere sicuro che si amplifica il DNA dell’organismo e non del parassita. Allora progetto i primer e vado a vedere se va ad amplificare anche il DNA dei parassiti.

Come vediamo dall’immagine quindi il programma mi trova i primer ma compare questa schermata dove viene riportato un codice e ci dice che il primer foward effettivamente funzionerebbe anche sul l’organismo collegato a quel codice.

In quest’altro caso invece vediamo come vengono riportati dei nucleotidi, vuol dire che lui ha trovato primer che vanno bene anche per questa specie ( Mizuhopecten yessoensis ) ma ci sono delle differenze e vengono appunto indicate. Queste differenze potrebbero significare che il primer non funziona per quell’organismo oppure che ci sono delle differenze ma funziona lo stesso. Ad esempio nell’immagine troviamo delle mutazioni lungo tutta la sequenza del primer e questo potrebbe portare a un malfunzionamento del primer. Ad esempio il foward e il reverse devono essere entrambi funzionanti, quindi non ci dovrebbero essere mutazioni, in special misura a livello del 3’ che non deve variare. Quando lavoriamo con risultati aspecifici dipende molto dalla temperatura che impostiamo nella PCR, una temperatura elevata può portare a mismatch che poi creano effettivamente dei problemi. Se invece la temperatura la teniamo bassa allora possono funzionare anche primers non perfettamente conservati. Per esempio se io voglio fare una PCR con primers universali quindi con primers 18S, 28S, 16S che amplificano lo stesso gene in tante specie io quando vado a impostare la temperatura di annealing nello strumento della PCR, non uso una temperatura alta perché voglio che funzioni il primer ma non sono sicuro che sia perfettamente identica la sequenza e quindi potrebbe esserci un mismatch. Quindi io tengo la temperatura di annealing più bassa per essere più sicuro che il primers universale funzioni perché io non conosco la sequenza del bersaglio del primers. Se io voglio amplificare evitando che ci siano aspecifici, ovvero non voglio prodotti secondari ma soltanto il mio gene, infatti non sono primers universali ma sono specifici per un gene, non voglio prodotti secondari allora tengo la temperatura di annealing più alta possibile perché voglio ottenere un primer che sia perfettamente complementare e che funzioni....