Aantekeningen colleges O&S jaar 2021-2022 PDF

Preview

Summary

Ontwerp en syntheseThema 1: Medicijn TargetsEr zijn verschillende klassen van eiwitten die als medicijn kunnen dienen, waaronder enzymen, ion kanalen, transport eiwitten, nucleaire receptoren en G-protein-coupled receptors (GPCRs)  Ongeveer een derde van alle targets zijn GPCRs.750-800 genen van he...

Description

Ontwerp en synthese

Thema 1: Medicijn Targets Er zijn verschillende klassen van eiwitten die als medicijn kunnen dienen, waaronder enzymen, ion kanalen, transport eiwitten, nucleaire receptoren en G-protein-coupled receptors (GPCRs)  Ongeveer een derde van alle targets zijn GPCRs. 750-800 genen van het genoom coderen voor GPCRs en er zijn verschillende klassen. In voor dit vak zijn klassen A, B en C van belang. Overeenkomstig tussen alle klassen zijn de N-terminus die ten opzichte van de cel naar buiten gaat, in het lipide membraan zitten zeven transmembrane alfahelices die in een soort cirkel tussen de lipiden zitten en de C-terminus gaat de cel in. De bindingsplaats, de orthosteric side, bevind zich altijd aan de buitenkant van de cel. Het allostere gebied kan overal voorkomen.

A

B

C

De grootste variatie binnen verschillende receptoren zit vooral op de N-terminus en in het specifiek op de orthosterische bindingsplaats. Het transmembraan laat over het algemeen het minste verschil zien en de C-terminus een beetje, omdat dat gebied in contact staat met het G-eiwit.  Dit wordt verklaard doordat er heel veel verschillende liganden zijn en relatief weinig G-eiwitten. Een G-eiwit is een trimeer eiwit bestaande uit een α en een βɣ subunit. De effector eiwit wordt geactiveerd/geremd door het G-eiwit. De agonist laat een reactie optreden na binding en de antagonist bindt zonder een verdere werking op de receptor uit te oefenen. Adenosine receptoren en hun liganden Adenosine receptoren vallen onder de klasse A van GPRCs. Het endogene ligand is adenosine en adenylaat cyclase fungeert als de effector en zet ATP om in cAMP. Er zijn verschillende subtypes van de adenosine receptoren, namelijk; A1 A2A, A2B en A3. A1 en A3 zijn gebonden aan de Gαi-eiwit, wat staat voor inhibitory en verlaagt dus de productie van cAMP. A2A en A2B zijn gebonden aan GαS (simulatory) en verhogen de productie van cAMP. De adenosine A1 receptor (A1R) bestaat uit 326 aminozuren, wat het een klein molecuul maakt. De receptoren zijn over het hele lichaam verspreid. Natuurlijke liganden (o.a. cafeïne en adenosine) binden relatief slecht aan hun receptor, want ze zijn niet selectief.

1

Het Van der Waals-oppervlak is een model van een molecuul, dat illustreert waar een oppervlak voor het molecuul zou kunnen zitten. De straal waarbinnen een atoom een invloedssfeer heeft. Binnen die straal kan een chemische reactie aangegaan worden met het molecuul. Wanneer er dan ook nog een elektronen dichtheid omheen getekend wordt, zegt het iets over de partiele lading en dit maakt iets duidelijk over de fysisch chemische eigenschappen van het molecuul. Door de natuurlijke ‘voorbeeld’ moleculen te overlappen met de nieuw gesynthetiseerde moleculen, kan er vergeleken worden. Zo kun je zien dat bijvoorbeeld een positieve groep en een negatieve groep op elkaar liggen (rode cirkel). Je gaat dan draaien tot de karakteristieke groepen matchen (negatief bij negatief etc.). Of dezelfde groepen kunnen op elkaar gelegd worden, dit is het ‘N 6-C8’ model. Farmacofoor zijn de voorwaarden waaronder een goed ligand gemaakt kan worden. Oftewel, de abstracte beschrijving van moleculaire kenmerken die nodig zijn voor moleculaire herkenning van een ligand door een biologisch macromolecuul. Het kan ook onderzocht worden via actieve analoge toenadering. In sommige gevallen is het fysisch niet mogelijk om nog extra groepen toe te voegen, waar dat wel nodig is. Er is dan een ruimte tussen het ligand en de receptor, wat eventueel zou kunnen bijdragen aan affiniteit en dergelijke. Om dit te voorkomen moet er aandacht besteed worden aan de receptor zelf. 3D eiwit structuren (dit komt niet actief in het tentamen maar dient als introductie) De 3D structuur van een eiwit kan op verschillende manieren verkregen worden.  Homologie modelleringen: Een bekende eiwit structuur wordt gebruikt om de structuur van een ander soortgelijk eiwit te bepalen. Dit gaat met behulp van de aminozuursequentie, die aan elkaar ‘aligned’ worden. Vervolgens worden de aminozuren aangepast en de structuur geoptimaliseerd, om bijv. botsingen te voorkomen en atoominteracties te versterken. Daarna moet er gekeken worden of liganden in het eiwit passen.  Om te bekijken hoe het eiwit eruit ziet is röntgenstraling nodig, aangezien de eiwitten vaak te klein zijn om de vouwingen te zien met zichtbaar licht. Dit werkt, doordat het atoom de energie opneemt en vervolgens weer uitstraalt in meerdere richtingen. Hetzelfde gebeurd bij elektromagnetische microscopie  Artificieel intelligence modellering: Een intelligente computer is gespecialiseerd in het vouwen van eiwitten. Partiële agonist: activeert de receptor niet maximaal. Door te bepalen wat een ligand een agonist maakt, kan je het agonisme optimaliseren. Structuur A2A De eerste kristal structuur die gevisualiseerd werd, was Rodopsine, wat geclassificeerd wordt als een GPRC. De expressie van rodopsine is heel hoog en het ligand wordt covalent gebonden. Verder is de homologie van rodopsine vrij laag in vergelijking tot ander GPCRs en bind het aan andere type G-eiwitten, waardoor de visualisatie net kansloos was.

2

De Adenosine A2A receptor is relatief lang (410 aminozuren), waarbij de lengte voornamelijk in de C-terminal zit. De receptor wordt in het CNS en de periferie tot expressie gebracht. De natuurlijke ligand voor de receptor, namelijk adenosine (links) heeft als hoofdzakelijk element een xanthine. Dus op basis van de xanthine zijn meerdere antagonisten gemaakt. Er zijn ook A2A antagonisten zonder xanthine als basis, maar die lijken er nog steeds erg op. ZM241385 is een non-xanthine en deze wordt mee gekristalliseerd in de A2A receptor.  Kristallisatie van transmembrane eiwitten is over het algemeen een stuk lastiger dan eiwitten uit het cytosol en daarom wordt er bij transmembrane eiwitten gebruik gemaakt van een construct. Het is ook van belang dat alle ‘losse’ onderdelen van het eiwit verwijderd worden en vervangen worden voor iets anders, vaak een signaalpeptiden (leidt tot hoge expressie). Voor het kristallisatie proces moet er veel van het receptor eiwit aanwezig zijn en daarom wordt het vermeerderd. Dit kan met behulp van o.a. celkweken en virussen. Dan wordt het membraan geprept en vervolgens opgelost = solubilization. Vervolgens moet de A 2A receptor gezuiverd worden. Gedurende het gehele proces was een stof aanwezig met een lage affiniteit tot de A2A receptor, die later weggewassen is en vervangen door ZM241385. Uit een keuze van 20.000 verschillende kristallisatie condities, waarvan een mix van monoolein en cholesterol optimaal was. De kristalstructuur wordt vervolgens gebruikt om een model te maken en dat te gaan ‘trainen’. Er worden dan verschillende liganden ingegooid, waarvan een aantal bekende antagonisten en heel veel decoy compounds die niet kunnen binden. Dan kan er gescreend worden met onbekende stoffen die kunnen binden met de receptor en vervolgens kunnen deze getest worden in de praktijk.

Thema 2: Medicijn Moleculen Organische chemie in medicijnen Wanneer de target ID en validatie van een stof is voldaan, kan high-throughput screening worden uitgevoerd. Dit is de screening van heel veel stoffen onder op een target. Deze stoffen zijn te vinden in een ‘bibliotheek vol stoffen’. Deze stoffen zijn o.a. verkregen via commerciële bronnen, academische onderzoeksgroepen, maar niet van andere farmaceutische bedrijven. Om als bedrijf meer stoffen in de bieb te stoppen, worden er soms projecten opgezet met bijv. bepaalde verbindingen die weinig voorkomen. Manieren om stoffen te synthetiseren, die allen bestaan uit organische synthese, maar behandelen verschillende aspecten van chemische complexiteit en diversiteit. - Doelgerichte synthese (TOS): Meest klassieke manier, waarbij een stof uit de natuur nagemaakt wordt in het lab. Wanneer lukt, kan dat leiden tot goedkopere productie van de stof, maar men kan er dan ook kleine aanpassingen in gaan maken. Dit wordt gedaan via retrosynthese (= analyse van omgekeerde syntheses) Hoe kan ik deze stof af breken en wat krijg ik dan en wat zijn de beginstoffen? - Parallelle synthese (PS): Maakt ook gebruik van retrosynthetische analyse, maar verschilt in dat er een variatie geïntroduceerd gaat worden. Hierbij werk je tot een common intermediair. - Combinatorische chemie (CC): Uit een mengsel van allerlei verschillende moleculen, komen er verschillende combinaties van deze moleculen in het reactie product. Verder 3

-

omvat het computersimulaties van moleculen en reacties tussen moleculen. Hierdoor ontstaat een grote diversiteit van moleculen, maar deze zijn gelimiteerd in complexiteit. Diversiteitsgerichte synthese (DOS): Werkt soortgelijk als CC, maar dit vind niet plaats in een batch, er is sprake van allemaal losse reacties. Deze reacties worden in parallel uitgevoerd. Het geeft de mogelijk om zeer complexe en diverse moleculen te synthetiseren, maar dit is alleen nuttig wanneer dat ook het doel is.

Wanneer er een hit gevonden is, kan deze nagemaakt worden met doelgerichte synthese. Er is een bepaalde richtlijn om een goede drug te hebben; molecuulmassa < 500, ≤ 5 waterstof bruggen, ≤10 waterstof brug acceptoren en een logP van ≤ 5. Verder heb je ook te maken met de ligand efficiëntie (LE) LE = , waarbij N de hoeveelheid niet-H atomen is. Target ligand interacties: - Covalente binding - Elektrostatische interactie (zoutbrug) - Waterstof brug - Van der Waals-interactie - Hydrofobe interactie  Deze interacties hebben een bepaalde energie, die een medicijn kunnen maken of breken, vooral de laatste 3. Er kunnen verschillende dingen veranderd worden aan een molecuul, waarbij je dan van een Hit-to-Lead gaat. Dit is het modificeren van de hit m.b.v. traditionele organische synthese. - Fragment growing: het toevoegen van substituenten. Gaat voornamelijk via parallelle synthese.

-

Scaffold morphing: een benadering voor het ontwerpen van geneesmiddelen om de synthetische haalbaarheid, potentie en gelijkenis met geneesmiddelen van moleculen te verbeteren door de structurele kenmerken ervan geleidelijk te wijzigen. Er worden dan gewoon groepen toegevoegd en verwijderd.

Parallelle synthese: wordt gebruikt om de ontdekking van nieuwe verbindingen te versnellen en om te screenen op optimale procesomstandigheden. In de farmaceutische industrie wordt parallelle synthese gebruikt voor de ontdekking en ontwikkeling van potentiële kandidaatgeneesmiddelen. Dit maakt bijvoorbeeld de synthese mogelijk van bibliotheken met diverse chemische structuren die kunnen worden gescreend op mogelijke biologische activiteit. 4

In eerste instantie is de opbrengst niet van belang, want zolang er voldoende is om te testen, is het prima. Wanneer de opbrengst overigens verbeterd kan worden, zal dit gedaan worden om minder materiaal te verbruiken etc. I.p.v. de opbrengst kan je ook kijken naar de atoom economie = aantal atomen uit uitgangsmaterialen opgenomen in het eindproduct. Over het algemeen heeft een lineaire synthese een lagere opbrengst dan convergente synthese.

Suzuki reactie: een organische reactie van een aryl- of vinylboorzuur met een aryl- of vinylhalide, gekatalyseerd door een palladium complex. De reactie wordt wijd gebruikt voor het synthetiseren van polyalkenen, styrenen en gesubstitueerde bifenylen. De vertrekkende groep (vaak een halogeen), die aan een aromatisch systeem zit, gaat een reactie aan met een boorzuur onder invloed van de palladium. Hierbij ontstaat een koolstof-koolstof band. Lead optimalisatie: Verfijning van de fysisch-chemische en farmacologische eigenschappen van lead verbindingen (met een hoge affiniteit). Het doel hiervan is om een potentiële preklinische drug te maken. - Oplosbaarheid - Lipofiliteit - Zuurgraad (pKa) - Biologische beschikbaarheid (tijdens in vivo tests) - Metabolisme/klaring (tijdens in vivo testen) - Toxiciteit en off-target effecten Uiteindelijk moet, wanneer de stof geoptimaliseerd is, er opgeschaald worden. Hierbij moet wederom rekening gehouden worden met de opbrengst, het verschil in grote- en kleinschalige experimenten en de consequenties van massa productie op het milieu etc. Structuur activiteit relaties  zoek andere aantekeningen van dit college Binnen de structuur van moleculen heb je kwalitatieve verschillen (Backbone, functionele groepen, vorm/grootte) en kwantitatief verschil (Elektronische (polaire interacties), lipofiel (pistapeling) LogP of pi, sterisch (ruimtelijke vraag) Sb of Es). Fysicochemische eigenschappen van liganden worden gerelateerd aan het biologische effect. - Kwalitatieve structuur-activiteit relaties: Aromatische verbindingen zijn goed, grote verbindingen passen niet in de bindingsplaats. - Kwantitatieve structuur-activiteit relaties (QSAR): Activiteit en lipofiliciteit hangen samen met een factor 1:2, verdrievoudiging van de elektronegativiteit van deze substituent vermindert de EC50 met 20%.

5

-

Semi-kwantitatief (SAR): Lipofiliteit aan deze kant van het molecuul lijkt de affiniteit te verhogen, een chlooratoom op deze aromatische ring verbetert de activering van de receptor.  Dit werkt alleen voor vergelijkbare liganden op een specifiek 1 target β-adrenerge receptor is een GPCR, die bestaat uit 2 subgroepen (alfa en beta) en hij wordt geactiveerd door (nor)adrenaline). - Beta blokker: tegen hoge bloeddruk - Beta activator: voor te lage hartslag Wanneer een groep stoffen erg op elkaar lijkt en alleen varieert in de R-groepen, kan zo een R-groep er juist voor zorgen dat een stof beter zal binden.

Vaak wordt er alleen gekeken naar een bepaalde R-groep, omdat eigenschappen zoals de logP etc. al bepaald zijn. QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships): QSAR-modellen zijn wiskundige modellen die farmacologische of biologische activiteit relateren aan de fysisch-chemische kenmerken (moleculaire descriptoren genoemd) van een reeks moleculen.

Thema 3: Medicijn Beoordeling Bindingsstudies Wanneer onderzoek gedaan wordt naar receptoren, kunnen er verschillende assays toegepast worden. Zo kan er op het gebied van GPRCs gekeken worden naar het membraaneiwit, de activatie van het G-eiwit, second messengers, reporter genen of cellulaire responsen. Wanneer er naar receptoren wordt gekeken, is de ligand [L], receptor [R] binding van belang en de verhouding tussen de twee. [LR] is het complex en deze kan vormen en uit elkaar vallen. De snelheid waarmee dit gebeurd is Kon en Koff. Het aantal bindingsplaatsen is beperkt, BMAX. Er zijn vrije receptoren [R] en gebonden receptoren, het complex dus, [LR].  Formule [R] + [LR] = BMAX. Het samenvoegen van alle vergelijkingen geeft de volgende vergelijking. KD is de affiniteit van het ligand.

Er ontstaat een curve die vergelijkbaar is met de Michaelis Menten grafiek. De hoeveelheid van de bezette receptoren wordt gegeven met:

Het receptor-ligand complex kan gemeten worden met een fluorescerende marker of een radio actieve stof. Wanneer er een radioligand binding studie wordt uitgevoerd, met een ideaal ligand. Deze is o.a. stabiel, getritieerd, hoge affiniteit (KD ~ 1 nM), lage niet-specifieke binding, optimale kinetiek (temperatuur) etc. Alleen de specifieke binding, dus de binding met de receptor moet gemeten worden. Dit kan op verschillende manieren, maar in dit college draait het om filtratie. Hierbij moet gemeten worden hoeveel van het ligand bind aan de receptoren (de eenheid = disintegrations per minute (DPM), dit meet de isotopen enzo).  De KD (= ligandaffiniteit) wordt maar 1x aan het begin van het onderzoek gemeten. Deze moet ook altijd hetzelfde zijn. Verdringer experiment: hiermee kan je de affiniteit meten van niet gelabelde verbindingen en ontstaat er competitie tussen de agonist en de andere stof.  Hiermee kan de IC50 bepaald worden. IC50 = een maat voor het vermogen van een stof om een specifieke biologische of biochemische functie te remmen. De IC50 moet nog getransformeerd worden tot een K i waarde, aangezien er door verschillen in concentratie verschillende IC50 waardes uit het experiment kunnen komen. Hill-plot, die lineair is getransformeerd. In dit voorbeeld is CCPA de agonist en DPCPX de antagonist. Hill-slope (nH) zegt iets over type receptor-ligand interactie (stoichiometrie). Bij GPCRs is het lastig om alle bindingsplaatsen van een ligand te voorzien. Een receptorsysteem kan worden afgebeeld als een balans tussen actieve (RA) en inactieve (Ri) receptoren. Antagonist: Ze hebben geen voorkeur voor actieve of inactieve receptoren, ze binden aan beide receptoren even goed. Agonist: Moet een stof of een proces in de cel activeren, dus heeft voorkeur om te binden aan actieve receptoren. Inverse agonist: Binden het liefst aan inactieve receptoren.

7

Receptor signaling Er zijn verschillende soorten G-eiwitten. Elk soort herkent een specifieke set van GPCRs en elke GPCR kan één of meer G-eiwitten herkennen. G-eiwitten hebben drie sub eenheden: alfa, bèta en gamma. Gα-GDP is gebonden aan een ‘stille’ receptor. De geactiveerde receptor resulteert in GDP/GTP-uitwisseling op Gα. Gα is een GTPase wat de Geiwitsignalering reguleert/beëindigt. G-eiwit (de)activatie cyclus:

GαS pathway is een van de bekendste pathways van de GPCRs. Het is een eiwit-gemedieerde activering van adenylyl cyclase, veroorzaakt vorming van de 2e messenger cAMP. De cAMP-gemedieerde activering van PKA ver-oorzaakt activering van trans-criptiefactoren.  Een stijging van cAMP kan gen transcriptie veranderen.

Gαi pathway: is de tegenhanger van Gα S en het is een inhiberend alfa eiwit. Remming van 'achtergrond' Gsactiviteit, waarbij het algemene cellulair effect af hangt van dominant G-eiwit, dat wordt bepaald door welke receptoren (constitutief) worden geactiveerd. Je kan dus alleen de activatie van Gαi eiwitten aantonen, wanneer er al een basale activatie van cAMP hebt.

Gαq pathway: Door Gq-eiwit gemedieerde activering 8

van het plasma membraan gebonden enzym PLCβ veroorzaakt de vorming van 2nd messengers DAG en IP3. DAG activeert eiwit kinase C, terwijl IP3 de afgifte van Ca 2+ uit intracellulaire winkels veroorzaakt. Ca2+-gemedieerde activatie van CaM-kinase veroorzaakt activatie van transcriptiefactoren.  Een toename in Ca2+ kan veranderingen geven in gen transcriptie. Een receptor system kan weergegeven worden als een balans tussen actieve (R A) en inactieve (Ri) receptoren, welke beïnvloed kan worden door een ligand. Een ligand wordt geclassificeerd op basis van de intrinsieke activiteit van het ligand. - Constitutieve activiteit: onder het nulpunt is er vaak nog sprake van activiteit. Dit is dus alles wat er gebeurd, wanneer er geen ligand aanwezig is. Om te kijken of een stof een agonist, een antagonist of iets ertussen is, moet er een functionele assay uitgevoerd worden. Er wordt een toenemende concentratie van de agonist en de antagonist toegediend om daar vervolgens conclusie uit te kunnen krijgen. Hiermee kan je o.a. de IC50 bepaald worden. Röntgen en cryo-EM De 3D structuur is bij eiwitten heel erg belangrijk, want de vorm geeft ze de werking. Dit maakt het DNA replicatie de drijfveer voor de evolutie, want het DNA bevat de informatie voor het maken en vouwen van de eiwitten.  In het DNA worden de fouten gemaakt, maar het selectie proces vind plaats op het eiwitniveau. Het eiwit kan na een aantal tijdeenheden weer afgebroken worden, maar de mutatie blijft voort bestaan in het DNA. Het DNA wordt heel vaak gerepliceerd, door het replisoom. Vervolgens wordt een klein deel getranscripteerd m.b.v. RNA polymerase en dit wordt vervolgens omgezet tot een eiwit (translatie) door de ribosomen.

(herhaling)

Bij translatie worden 4 DNA letters (GATC) gelezen in combinatie van 3 letters. Dit vormt in totaal 20 typen aminozuren. Deze aminozuren worden aan elkaar gekoppeld door het ribosoom (m.b.v. EPA sites in het ribosoom).  Eiwitten krijgen hun structuur, doordat bepaalde hoeken energetisch gezien meer gunstig zijn, waardoor die structuren ‘elkaar opzoeken’. Hierdoor worden bepaalde structuren uit zichzelf gevormd. De primaire structuur is dus alleen de aminozuur keten en de secondaire st...