ADN Recombinant, Despouy PDF

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cours sur l'ADN recombinant et les méthodes d'étude...

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Technique ADN recombinant

2020

Méthodologie de l’ADN recombinante I. Aspect historique Evolution de la biotechnologie : • 1953 : Découverte de la structure de l’ADN • 1961-65 : identification du code génétique • 1968 : Découverte des endonucléases (enzyme) de restriction • 1970 : Découverte transcriptase inverse (ARN ADNc) • 1973 : clonage de l’ADN • 1975 : o Production d’Ac monoclonaux o Technique de Southern blot • 1977 : o Clonage d’un gène humain o Séquençage d’ADN enzymatique o Séquençage d’ADN chimique o Séquençage de Northern blot • 1982 : Approbation de l’insuline recombinante • 1985 : Introduction de la PCR (polymerase chain reaction) • Fin 80-90 : o Thérapie génique o Produits biologiques approuvés pour l’utilisation clinique o Approche globale génomique protéomique

Technologie de l’ADN recombinant (principe) : • Organe donné : extraction et coupure de l’ADN en fragment contenant un à plusieurs fragment intérêt • Vecteur : ou transporteur d’ADN et de l’introduire dans un autre organisme. Fragment d’ADN capable de réplication autonome.  Obtention de l’ADN recombinant que l’on amplifie  purification/extraction  introduction dans un organisme = OGM

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Les outils enzymatiques agissant sur les Acides nucléiques A. Les enzymes coupant l’ADN et ARN a. Nucléase, ADNase et ARNase II.

Nucléase : Enzyme qui permet l’hydrolyse des liaisons phosphodiester des Ac nucléiques Plusieurs types, reconnaissent : • ADN et ARN = Nucléase • ADN = Désoxyribonucléase / ADNase • ARN = Ribonucléase / ARNase Peut agir sur : • Ext d’une chaine  exonucléase • Dans une chaine  endonucléase Nucléase autre qu’enzyme de restriction : • DNase I (Désoxyribonucléase I) : o Endonucléase : agit sur ADN db ou sb o Coupe préférentiellement après une pyrimidine (C ou T) o Application : elimination ADN contaminant lors purification ARN • RNase H : o Endonucléase : dégradation ARN des hybrides ADN-ARN o Application : Elimination brin ARN lors RT (transcriptase inverse) • Nucléase SI o Endonucléase, extrait Aspergillus o Dégrade spécifiquement Ac nucléiques sb (ADN ou ARN) o Application : élimination extrémités cohésives pour clonage b. Enzymes de restriction ADNase qui agit au milieu de la chaine double brin : endonucléase spécifique ADN db  fragments d’ADN 2 applications : • Analyse facilitée de l’ADN génomique (ex : Southern blot, digestion ADNg) • Construction molécules d’ADN recombinants Enzymes de restriction : produites par des bactéries, responsable de phénomènes de restrictions, coupure ADN bactériophages, donc systèmes de défense bactérien

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Elle reconnaissent des séquences de 4-8 nucléotides, l’ADN bactérien est non attaqué par ses propres enzymes car : ADN ne possède pas de sites reconnus, ou possèdent des sites de méthylation (A ou C)  Enzymes de restriction inactive sur les bactéries Reconnait des séquences d’ADN db, après reconnaissance dépend du type d’enzyme : • TYPE I : coupe à 1000-5000pb de la séquence reconnue • TYPE II : la plus intéressante, car coupe au niveau de la séquence de reconnaissance • TYPE III : coupe à 20 pb de la séquence reconnue Nomenclature : Beaucoup d’enzyme > 3500 connues à ce jour 1) 1majuscule + 2 minuscules : Eco RI, Eco RV, Pst I 2) 3 premières lettre (italique) = abréviation organisme hôte (espèce + genre) Eschérichia Coli 3) 4eme lettre éventuellement présente = nom souche Eschérichia coli Ry 13 4) Chiffre romain = n° découverte enzyme dans même bactérie Enzyme type II : • Séquence reconnue : 4-8 pb = palindrome mais avec complémentaire ! IMAGE • 2 types de coupure : o Coupures au même endroit sur les deux brins : bouts francs o Coupures décalées, l’enzyme ne coupe pas en face, mais au même endroit : bouts cohésifs

Schizomères : Enzyme type II, produit par bactéries différentes, mais reconnaissant et coupant même séquence. Mais coupure pas forcement sur les mêmes bases. • Isoschizomères : coupant au même niveau

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Néoschizomères : ne coupant pas au même niveau

B. Enzyme assurant la ligature = ligases Forment une liaison phosphodiester : entre ext 3’-OH et ext 5’-P, de 2 nucléotides déjà incorporés a. T4 ARN ligase Récupéré du phage, ligature entre 2 ARNs (avec hydrolyse d’ATP)  liaison phosphodiester

b. ADN ligase E. Coli Vient de E. Coli : ligature si 2 bouts sont correctement positionnés l’un par rapport à l’autre. • Après extrémités cohésives • Après coupure sb dans ADN db

c. c. T4 ADN ligase Plus efficace pour ligature entre 2 ADN à bout franc, avec hydrolyse ATP C. Les enzymes recopiant les Ac nucléiques a. ADN polymérase

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Polymérise à partir d’un brin matrice, dans la réplication. Polymérisation de l’ADN : • Brin parental : matrice lue dans 3’ 5’ pour synthèse 5’ 3’ • Complémentaire et antiparallèle  importance appariement bases Enzymes responsables de l’ADN pol : • Taq polymérase = ADN pol thermostable isolée à partir Thermus Aquaticus. Elongation 5’ 3’. o Besoin de :  Brin matrice  Amorce  dNTPs  Mg2+ o ½ vie : 40 min à 95°C  Dépourvue activité exonucléase  pas correction erreur pendant la copie  Ajoute 1 A en 3’ du fragment PCR  utilisation pour clonage (plasmide avec T débordants) o Application : PCR • ADN pol I : Enzyme tri-fonctionnelle o Polymérase 5’ 3’ o Exonucléase o Polymérase 3’ 5’ b. Transcriptase inverse = ADN polymérase ARN-dépendante, n’a pas besoin de matrice ADN, mais d’une matrice ARN. Permet de créer un brin complémentaire à l’ARN • Origine virale : o Virus de myéloblastose aviaire (AMV) o Virus murin de Moloney (MMLV) • Possède activité Rnase H : hydrolyse ARN dans hybride ADN-ARN Exigence transcriptase inverse (RT) • Besoin : o Matrice ARN + amorce o Forte concentration dNTPs o K+, Mg2+, … Synthèse ADN à partir amorce et matrice ARN

Application : synthèse ADNc pur RT-PCR, 2 étapes : • Synthèse 1er brin avec amorce oligo dT

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Synthèse 2eme brin avec amorce PCR

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c. ADN polymérase I ADN pol I d’E Coli = enzyme tri-fonctionnelle : • Polymérase 5’3’ • Exonucléase 3’5’ • Exonucléase 5’3’ Application : marquage sondes pour détection ADN (pour southern blotting) ou ARN (Northern blotting) d. ARN polymérase Dans la transcription. Polymérisation ARN, liaisons définissent un SENS à la molécule : • Début = nucléotide dont triphosphate en 5’ est libre • Fin = nucléotide dont fonction alcool en 3’ est libre Types ARN pol : • SP6 RNA pol : extrait Salmonella typhimurium • T7 PNA pol : extraite d'E.Coli infectées par phage T7 • T3 RNA pol : extraite d'E.Coli infectées par phage T3  Transcription possible si ADN contient 1 promoteur spécifique Application : transcription in vitra  synthèse ARN radioactifs (4NTPs dont 1 radioactif) ARN synthétisé : • Complémentaire du brin matrice = non codant = anti-sens • Mais même séquence que brin ADN non matrice = codant = sens • Mais contient U au lieu de T III. Principales étapes du clonage A. Vecteur de clonage a. Propriétés Le clonage moléculaire consiste à isoler et purifier un gène ou un fragment d’ADN d’un organisme donné puis le multiplier à l’identique en « l’insérant » dans une molécule ADN « porteuse » appelée vecteur permettant son amplification. Cet ADN recombinant est ensuite introduit dans un autre organisme, le plus souvent unicellulaire (bactérie ou levure) ou parfois dans une cellule en culture provenant d’un organisme pluricellulaire

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Etapes : • Récupérer ADN à cloner o ARNm o ADN • Ligature ADN dans le vecteur choisi • Introduire vecteur/ADN ligaturés dans E. Coli = transformation ou empaquetage • Sélection clones Vecteur de clonage : séquence nucléotidique capable de s’autorépliquer et utilisée pour la recombinaison in vitro de l’ADN (ligature d’un fragment d’ADN) et son amplification extra-chromosomique

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Vecteurs de clonage : uniquement capable de transporter le fragment d’ADN qu’ils contiennent. Vecteurs d’expression : résistance à un antibiotique, site de clonage multiple reconnu par les enzymes de restriction (polylinker). Utile pour intégrer l’ADN dans le vecteur après sa digestion. Pareil que vecteur de clonage mais terminateur et promoteur fort en plus, qui permet l’expression de ce gène par l’organisme hôte. Nécessité d’un promoteur o Procaryote o Eucaryote Promoteur et séquences de terminaison et transcription spécifiques.

SCM / MCS : site de clonage multiple (polylinker) : Court segment d’ADN qui va contenir de nombreux sites de restriction

Différents vecteurs de clonage : Se distinguent en fonction de la taille que l’on veut intégrer dans le vecteur : Type de Vecteur ADN cloné en kb 10 Plasmide Phage lambda 25 Cosmide 45 Phage PI 100 BAC 300 YAC 1000 Le plasmide est un type de vecteur. (ex : plasmide, on ne peut pas mettre plus de 10kb) (Propriétés d'un vecteur de clonage : • Réplication dans cellule hôte de manière autonome • Taille plus petite possible o Manipulation aisée clones recombinants o Obtention rapide grande q copies par cellules hôte

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Site de coupures uniques (par enzyme restriction) Sélection simple des bactéries contenant vecteur (par gènes de résistance) Persistance dans hôte sans modification (qq soit nombre générations), toutes les bactéries qui ont intégré le vecteur survivent Pas de perturbation dans cellule hôte, rien n’est exprimé Purification aisée, récupération facile)

b. Plasmides ADN qui fait parti du génome bactérien, ils portent des gènes qui servent généralement à l’adaptation de la bactérie, on les améliore suivant ce que l’on veut en faire Taille : 2-5 kb ADN à insérer < 10kb Plasmide inséré dans bactéries par transformation Différents types : • 1ère génération = plasmides naturels bactériens • 2ème et 3ème générations = plasmides chimères modifiés, de plus en plus performants o 2ème génération : pBR (ex : pBR322) o 3ème génération : pUC, pGEM, pBlueScript... • dernière génération = plasmides modifiés de + en + performants Plasmide de clonage  amplification d’un fragment d’ADN Plasmide d’expression  expression de l’ARNm et de la protéine Plasmide de clonage  Réplication dans cellule hôte de manière autonome  Taille la plus petite possible : o Manipulation aisée clones recombinants o Obtention rapide, grande quantité de copies par cellule hôte  Sites coupures uniques (par enzymes restriction)  Sélection simples des bactéries contenant vecteur (par gènes de résistance)  Persistance dans hôte sans modification

Un gène de résistance à l’ampiciline, un gène de résistance à la tétracycline

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On décide de mettre notre inser au niveau de PSTI, on va étaler les bactéries sur des boites contenant de l’ampiciline ou de la tétracycline. Si le clone que l’on sélectionne ne sont que des clones poussant sur tétracycline mais pas capable de pousser sur ampiciline : bactérie résistante à tétracycline mais résistante à ampiciline  plasmide résistant à tétracycline Bactérie capable de pousser sur les 2 : plasmide



Gène LacZ  synthèse β-galactosidase o Ajouter X-gal (=analogue lactose) sur boite gélose  Bleu : plasmide sans insert = vide  lacZ fonctionnel, exprime la β-galactosidase  Blanc : plasmide avec un insert, non pas exprimer la β-galactosidase  perte gène LacZ

Plasmide d’expression : • ADN circulaire d’origine bactérienne • Considérée comme un mini-chromosome capable de réplication autonome • Confère la résistance à un ou plusieurs antibiotiques • Permet la transcription de l’ADNc dans l’hôte (promoteur)

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Notion de promoteur :

Différents types de vecteurs d’expression selon leur utilisation :  Pour production protéines en bactéries (Pr bactérien  ARN  protéines dans bactéries !)  Pour production protéines en cellules eucaryotes (Pr viral CMB ou SV40  ARNm  Protéines dans eucaryotes !)  Permettant clonage ADNc en aval ou en amont d’une étiquette (Ex : séquence codant Flag, 6His, GST, GFP, Luciférase…) Plasmide d’expression (procaryote) :  Promoteur procaryote (PLac)  5’ MCS  Séquence codant la GFP  Multi

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Plasmide d’expression (eucaryote) : 3 sortes • Vecteur commun d’expression • Plasmide étiquette GFP • Plasmide activité promotrice : pour étudier un promoteur

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Différentes étiquettes (tags, flags) : – flag = DHYKDDDDK → purification / détection grâce à des anticorps anti-flag – 6xHis = His-His... x6 → purification sur colonne Ni2+ – GST (glutatione sciatyl-transférase) → purification sur colonne GSH – GFP (green fluorescent protein) → expression protéine fluorescente – Luciférase → émission lumière en présence luciférine + ATP

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B. Construction de la molécule recombinante Clonage moléculaire : • 1 préparation vectrice : o Enzyme restriction  bouts francs ou cohésifs o Phosphatase alcaline  déphosphorylation en 5’  Vecteur ne peut pas se refermer sur lui-même ! • 2 Préparation ADN à cloner : o Enzymes restriction → boûts francs ou cohésifs mais même que vecteur • 3 Ligature : o ADN ligase (E. Coli ou T4 DNA ligase) o Ratio insert/vecteur =environ 3/1, plus d’insert que de plasmide, pour avoir le même nombre d’insert que de vecteur (pb) Insertion d’un fragment d’ADN dans un plasmide bactérien Utilisation ADN ligase :

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Ligature (plasmide + insert) • Bout cohésif • Bout franc • Bout franc + bout cohésif

Ex : Plasmide avec un site EcoRI :

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Insertion simple : • Plasmide vide • Enzyme restriction à un site unique • ADN à insérer inf à 10kpb • A4 ADN ligase, 15-24 h à 15°C  Plasmide recombinant, mais aussi un plasmide qui se sera refermé sur lui-même.

Utilisation d’une phosphatase alcaline • Plasmide vide • Enzyme restriction à site unique • Phosphatase alcaline (vecteur) • Adn à insérer • T4 ADN ligase  Plasmide recombinant, mais que 2 points de ligature. On oblige la ligature à un insert par cette méthode. Le plasmide ne peut pas se refermer sur lui-même.

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Stratégies de ligature : • 1er cas : vecteur et insert avec 2 extrémités cohésives identiques o Insert : 5’ – GA ATTC - 3’ o Vecteur : 3’ - CTTA AG - 5’  2 sens d’insertion possibles 2ème cas : vecteur et insert avec 2 extrémités cohésives différentes o Insert : 5’- GAATCC –3’ + 5’- CTGACAG –3’ o Vecteur : 3’– CTTAAG –5’ + 3’– GACGTC –5’  1 seule orientation possible – ligature : ADN ligase E.Coli ou T4 •

• 3ème cas : vecteur et insert avec 2 bouts francs  2 sens d’insertion possibles 4ème cas : vecteur et insert avec 1 extrémité cohésive + 1 bout franc o Insert : 5’- GAATTC -3’ + bout franc 5’- GGGCCC -3’ o Vecteur : 3’- CTTAAG -5’ + bout franc 3’- CCCGGG -5’  1 seule orientation possible •

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Ligature : ADN ligase E. coli ou T4

C. Propagation de la molécule recombinante Choix hôte Clonage d’un fragment d’ADN

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Bactéries : manipulation rapide (20-30 min), facile à manier, peu onéreuses et non pathogènes E. Coli : res (-) rec A (-) mod (-) o res (-) : souche dépourvue enzyme restriction  ADN recombinant non détruit ! o rec A (-) : souche dépourvue protéines permettant recombinaison ADN  Pas recombinaison entre ADN recombinant et ADN bactérien o mod (-) : pas enzyme modification

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Autres caractères : o Ex : AbS résistance à antibiotique sera apportée par vecteur

Transformation : • Après choix bactérie : E coli : res (-) recA (-) mod (-) 1) Mise en compétence bactérie = traitement par CaCl2  Altération perméabilité des bactéries 2) Transformation des bactéries compétentes avec ADN recombinant • choc thermique (42° puis 4°)  ADN recombinant pénètre dans bactérie Sélection et criblage 3’) Sélection bactéries transformées sur Ab  Obtention avec 1 banque bactéries transformées = avec différents ADN recombinants (vecteur seul ou vecteur recombinant 1 colonie bactérienne = 1 ADN recombinant (vecteur) 4’) Purification vecteurs recombinants  Minipréparation de plasmides 5’) Criblage bactéries transformées  Digestion du vecteur purifié (enzyme de restriction)  Vérification par migration sur électrophorèse Soit extraction ADN plasmidique ou génomique : Extraction purification d’ADN plasmidique :

Extraction / purification d’ADN génomique

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Différentes étapes du clonage moléculaire : a. Electrophorèse d’ADN  Acides nucléiques = macromolécules polyanioniques (-) •

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1) 2) 3) • • 4) 5)

Vitesse de migration est fonction : o Masse moléculaire (c’est-à-dire nombre de pb de l’ADN, 1 pb = 660 Da) o Concentration agarose ou acrylamide  séparation suivant la taille o Distance de migration inversement proportionnelle au log10 (taille du fragment) Choix de support et de sa concentration : o Gel polyacrylamide pour séparer petits fragments ≤ 1 000 pb Exemple : 4% acrylamide  200 à 800 pb 11%  10 à 50 pb o Gel agarose (le plus utilisé)  concentration entre 0,6% et 1,5% Taille des fragments pouvant être séparés : 500 à 10 000 pb Coulage du gel et du montage Chargement Migration Bleu de Xylème cyanol est comparable à celle d’un fragment d’ADN de 4000pb Bleu de bromophénol est comparable à celle d’un fragment d’ADN de 300 pb Visualisation sous UVs Photo

Intercalant dans le gel d’agarose :

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Le marqueur de masse moléculaire : chacune des bandes correspond à une taille en pb, il est pour l’ADN double brin et simple brin ou ARN sb. Révélation d’un gel d’électrophorèse : • BET = bromure d’éthidium = drogue intercalante de l’ADN • Son pouvoir de visualisation sous UV est très fort lorsqu’il est lié à de l’ADN (x20) • BET intercalé entre les bases de l’ADN : fluorescence rouge / orange • Sous UV (280 nm), ADN visualisé • En pratique : o Introduit dans le gel avant migration o Immersion gel dans BET après migration Problème : BET est un mutagène très puissant Solution : Utiliser un produit plus sécuritaire SYBR Safe, SUBR Grenn I, SYBR Gold, GelRed Etalonnage de la taille des fragments :

Marqueur de Masse Moléculaire ADNdb = ensemble fragments de taille connue (1kb DNA ladder) IV. Détection/amplification A. Carte de restriction et séquençage a. Carte de restriction (électrophorèse fragments de restriction) Fragments de restriction : Fragments obtenu après action des enzymes de restriction  analyse par électrophorèse en gel  Localiser des séquences de l’ADN initialement Carte de restriction : classement par taille des fragments obtenus après action des différentes enzymes de restriction sur une région ADN donnée. → localisation des sites de coupures

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Technique ADN recombinant Ordre d'enchaînement des nucléotides 2 avantages : comparaison de différentes régions d'ADN et localis...