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Análisis morfológico por SEM y TEM Ana Paulina Arango Carmona ([email protected]) & Nicolás Zambrano Cortes ([email protected]) Universidad Autónoma de Manizales Manizales, Caldas 10/12/2019 Abstract - SEM and TEM analysis are of great importance for obtaining information on the composition of materials, among other characteristics. The material analyzed in this case was silica (

Si O2

) where particles of very varied

size could be found, the dimensions of 30 of said particles were obtained, a histogram with said values was performed, and finally a curve was chosen to fit the shape of the histogram. Key words- SEM, TEM, analysis, composition, silica, size, dimensions Figura 1. Ejemplo de la resolución del SEM [1]

I.

INTRODUCCIÓN

Los análisis morfológicos se realizan con la finalidad de obtener información composicional, topográfica y morfológica de los materiales. Dichos análisis permiten además conocer la pureza del material al posibilitar observar de una mejor manera la composición de éste. La composición del material puede variar dependiendo su utilidad, su costo y su modo de fabricación, por lo que en la mayoría de materiales se puede encontrar diferentes componentes como es el caso de las aleaciones, donde se produce un material metálico, resultado de una aleación, en el que se encuentra dos o más elementos que lo componen, donde al menos uno de ellos es un metal. El material analizado en este caso fue el sílice u óxido de silicio (

Si O 2

), el cual se puede encontrar en forma

de cuarzo cuando se organiza espacialmente en una red tridimensional, generalmente, se utiliza como cerámico, vidrio artificial, entre otros. II.

MARCO TEÓRICO

El procedimiento de Microscopía Electrónica de Barrido conocido por sus siglas SEM, se caracteriza por ser un procedimiento que permite la obtención de información composicional, topográfica y morfológica de los materiales a analizar, este procedimiento en específico se basa en “el principio de la microscopia óptica en la que se sustituye el haz de luz por un haz de electrones. Con esto se consigue hasta los 100 Å, resolución muy superior a cualquier instrumento óptico [1]”, resolución que se puede observar en la Figura 1.

Su funcionamiento consiste en “hacer incidir un barrido de haz de electrones sobre la muestra. La muestra (salvo que ya sea conductora) está generalmente recubierta con una capa muy fina de oro o carbón, lo que le otorga propiedades conductoras [1]”. Las muestras destinadas al SEM han de cumplir dos condiciones: deben estar secas y ser conductoras. Para preparar las muestras de forma que cumplan la primera condición: estar secas, se utilizan dos tipos diferentes de técnicas que consisten en preservar al máximo la estructura original de la muestra. La primera técnica consiste en utilizar “el método clásico de fijación y deshidratación química que el usuario realiza en su laboratorio y que finaliza con el secado por punto crítico en nuestras instalaciones [2]”, o utilizar el moderno método de “fijación física por crio fijación que ya está acoplado a uno de los microscopios [2]”. La técnica de preparación de las muestras para volverlas conductoras se denomina “sputtering” o pulverización catódica, y también existen dos técnicas que se utilizan con el fin de recubrirlas de material conductor; la primera técnica se denomina Recubrimiento de muestras en bajo vacío con el cual es posible realizar dos tipos de recubrimientos: “sputtering de oro para obtener las mejores condiciones de imagen y, si se requiere microanálisis por rayos X, el recubrimiento por hilo de carbono [2]”. La segunda técnica se denomina Recubrimiento de muestras en alto vacío, la cual se utiliza no solo para el análisis SEM sino TEM (del cual se hablará más adelante), esta técnica consiste en “recubrimientos de grano mucho más fino y está preparado para realizar “sputtering” con distintos metales. También trabaja por el método de evaporación, con lo que aumenta el rango de posibles elementos de recubrimiento. Utiliza electrodos de carbono para evaporarlo y obtener “films” que recubren las rejillas destinadas al TEM [2]”. El procedimiento de sputtering

puede entenderse con la Figura 2 mostrada a continuación.

Figura 2. Técnica de sputtering [2]

El microscopio se encuentra internamente equipado con unos detectores que recogen la energía y la transforman en las siguientes imágenes y datos: Detector de electrones secundarios: (SEI – Secundary Electron Image), con los que obtenemos las imágenes de alta resolución, Detector de electrones retro dispersados: (BEI – Backscattered Electron Image), con menor resolución de imagen, pero mayor contraste para obtener la topografía de la superficie, Detector de energía dispersiva: (EDS – Energy Dispersive Spectrometer), detecta los rayos X generados y permite realizar un análisis espectrográfico de la composición de la muestra. [1]. Dichos detectores y demás partes del SEM pueden observarse en la Figura 4.

El proceso de preparación comienza “enfriando la muestra a la máxima velocidad posible mediante nitrógeno nieve. A continuación, ya pasa al sistema de crio observación, donde se puede fracturar, sublimar el hielo superficial y recubrir con oro o carbono para su observación y/o análisis. La ventaja de este sistema es que se puede observar cualquier muestra biológica o hidratada con una preparación mínima y rápida con una buena preservación estructural [2]”. El microscopio electrónico de barrido (SEM), mostrado en la Figura 3, se dota de un sistema capaz de observar la muestra a muy baja temperatura de forma que su preservación estructural es máxima y la capacidad de trabajo del microscopio no se afecta en absoluto, ya que no se trata de una muestra hidratada. Figura 4. Partes del microscopio SEM [1]

El procedimiento realizado por TEM o Microscopía Electrónica de Transmisión, es una técnica similar al procedimiento SEM, con similares funciones como obtener información composicional, topográfica y morfológica de los materiales.

Figura 3. Microscopio Electrónico de Barrido (SEM) [1]

Luego de estar preparado para el análisis, la muestra se ingresa al microscopio SEM, donde al alcanzar el haz la superficie de la muestra, se generan principalmente las siguientes partículas: Electrones retro dispersados (e1), Electrones secundarios (e2), radiación electromagnética (rayos X) y otras partículas menos significativas.

Su funcionamiento se basa en “un haz de electrones de alta energía (300 keV) que atraviesa una muestra muy delgada (menor a los 150 nm), lo que altera varias propiedades físicas del haz de electrones que son recopiladas por diversos detectores: Detector de amplio ángulo HAADF, CCD de alta velocidad y GIF (para EELS y EFTEM) [3]”. La iluminación con el haz de electrones se puede realizar de dos maneras: “en TEM con iluminación constante sobre la muestra y en STEM donde un haz muy pequeño (“nanoprobe”) que barre la muestra en un área rectangular [3]”. De acuerdo al funcionamiento de la lente objetiva tenemos dos modos de operación del instrumento: en Modo Imagen y en Modo Difracción. Por otro lado, al interaccionar el haz de electrones con la muestra, esta última emite rayos X característicos que son “colectados por un detector EDS especial [3]”. El funcionamiento puede entenderse con la Figura 5, mostrada a continuación.

Figura 5. Funcionamiento del TEM [3]

Las características principales de este tipo de análisis son: Obtención rápida de imágenes de alta resolución, rápida identificación de los elementos presentes en la muestra, se requieren muestras compatibles con vacío, podría dañar la muestra para análisis posterior, la resolución depende fuertemente de la muestra y su preparación, la muestra no debe tener material orgánico, a menos que se encapsule de una manera especial, se pueden analizar muestras conductoras y no conductoras, en algunos casos con una preparación especial, los patrones de difracción obtenidos pueden ser bien interpretados, gracias a la precisión del haz. [3].

 Muestras biológicas: La preparación de este tipo de muestras se basa en “la fijación química, lavado, deshidratación en series de concentraciones crecientes de alcohol o acetona, inclusión en resina y polimerización. Según el objetivo perseguido, en alguno de estos pasos se incluye una etapa de tinción con metales pesados, tales como el osmio, el wolframio o el uranio. La siguiente etapa consiste en obtener cortes muy finos del material polimerizado, para ello se utiliza un ultramicrótomo [4]”.  Muestras en polvo: En la preparación de este tipo de muestras “sólo hay que diluir una cantidad muy pequeña de muestra en un disolvente orgánico que no la afecte, habitualmente dicloroetano o acetona. También se puede utilizar agua si no hay alternativa. A continuación, se busca la máxima dispersión sumergiendo la solución en un baño de ultrasonidos y, al cabo de un tiempo, ya se puede depositar una gota sobre una rejilla filmada con carbono para ser observada directamente una vez se haya secado [4]”.  Muestras compactas: Para este tipo de muestras se sigue un proceso de adelgazamiento en el que es necesario la utilización de varios aparatos. “En primer lugar, el usuario ha de aportar una muestra que no supere las 200 µm de grosor. A continuación, el primer paso es cortar un disco de 3 mm. de diámetro con el “Ultrasonic Disk Cutter” pues este es el tamaño de la muestra que se puede introducir en el TEM. El siguiente paso es excavar el disco por ambas caras hasta obtener una zona central de unas 20 µm con el “Dimpling Grinder”. Una vez conseguido, se introduce este disco en el “Ion Milling” para que sea atacado por ambos lados con sendos haces de iones de argón hasta que estos realizan un pequeño orificio central, alrededor del cual queda una zona suficientemente delgada [4]”. El microscopio electrónico de transmisión se muestra en la Figura 6, a continuación.

Como la muestra en el TEM debe ser menor a 150-100 nm, las técnicas de preparación de las muestras a analizar se basan en adelgazar las muestras incluso para muestras biológicas. Dichas técnicas pueden ser diferentes para cada tipo de material: Figura 6. Microscopio electrónico de transmisión [3]

III.

28 29 30

MÉTODOS Y RESULTADOS

0,665 0,971 0,892

11,6503153 17,0112123 15,6271899

Tabla 1. Medidas de las partículas de la muestra

En el análisis realizado a una estructura de Sílice (

Si O 2 ¿

en un microscopio tipo SEM, se obtuvo la

siguiente imagen (Figura 7):

A continuación, se presentan en la Figura 8 visualizaciones de algunas partículas medidas con el software Image J:

a

Figura 7. Análisis por SEM de una estructura de Sílice

Con el software Image J, se obtuvo medidas de al menos 30 diferentes partículas encontradas en la imagen, estas medidas se pueden observar en la Tabla 1, donde se encuentra en la primera columna el número de muestra, en la segunda columna el valor obtenido con el software Image J y en la tercera columna la medida de cada muestra con respecto a la escala de 50 nm que se encuentra en la Figura 7: Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Valor 0,958 0,840 0,855 1,114 0,8 0,876 1,173 0,797 0,943 0,647 0,811 0,824 1,208 1,186 1,053 0,956 0,713 0,863 0,938 0,85 0,933 0,947 1,055 0,773 0,821 1,147 0,812

Valor (nm) 16,7834618 14,7161878 14,9789769 19,5164681 14,015417 15,3468816 20,5501051 13,9628591 16,5206727 11,3349685 14,2081289 14,4358795 21,1632796 20,7778556 18,4477926 16,7484233 12,4912404 15,119131 16,4330764 14,8913805 16,34548 16,5907498 18,4828311 13,5423966 14,3833217 20,0946041 14,2256482

b

c

d

e

depositado hidroxiapatita mediante un fluido fisiológico simulado.

Figura 8. a. muestra 3, b. muestra 4, c. muestra 8, d. muestra 13 y e. muestra 21

Posteriormente, se llevó al software Origin donde se obtuvo un histograma correspondiente a los datos obtenidos y una curva que se identificara con dicho histograma, en este caso, la curva que mejor se adaptó fue la curva Normal, el histograma y curva Normal se muestran en la Figura 9, a continuación:

En un diferente estudio, realizado por tres investigadores (Aguiar, Serra y González), se presentan resultados acerca de los biovidrios como materiales para la salud, encuentran que además de ser biocompatibles, son bioactivos, es decir, al relacionarse con material biológico permiten una mejor adherencia y pueden contribuir a un rápido desarrollo estructural en los casos que lo requieren. En el estudio se muestran diferentes biovidrios, entre los cuales se encuentra la sílice, sin embargo, entre los resultados se puede encontrar las características propias que se obtuvieron de los biovidrios en general, dichas características como ser un material biocompatible, de carácter osteoconductivo, el cual consiste en el favorecimiento de la adhesión, el crecimiento y diferenciación de las células de osteoblasto; otra característica es el carácter osteoinductivo, el cual consiste en la liberación de iones que generan señales bioquímicas que promueven los procesos morfogénicos, además de su biodegradabilidad, que permite la degradación del material sin presentar efectos citotóxicos en el organismo [7]. V. 



 Figura 9. Histograma y curva Normal

En el histograma se puede observar que los valores obtenidos del tamaño de las partículas varían entre 10 a 22 nm, también se puede interpretar de dicha gráfica que gran parte de las partículas medidas concentran un tamaño entre 14 a 18 nm, y que existen algunas excepciones de partículas donde su tamaño es mucho mas pequeño en comparación. IV.

APLICACIONES

Las aplicaciones más comunes que puede representar la sílice como biomaterial pueden ser en forma de biovidrio o biocerámico, debido a su composición. En un estudio realizado por la Universidad Autónoma de Puebla [6], se evidenció que, al utilizarse un recubrimiento hecho con sílice entre otros compuestos, dicho recubrimiento tuvo las características necesarias para considerarse biomaterial, en dicho estudio el recubrimiento de PMMA-sílice-CaO sirvió como película sobre el acero inoxidable 316L, en el que fue



CONCLUSIONES

La variación en las medidas de los tamaños de las partículas puede deberse a un error en la medición a partir del software Image J. Las partículas muy pequeñas se midieron a percepción del ojo humano, sin realizar acercamientos, por lo que las medidas reales pueden ser diferentes a las medidas obtenidas. La técnica de SEM y TEM deben ser utilizadas a manos de un experto que realice los procedimientos pertinentes y preparaciones a los materiales a analizar. Las consecuencias que conllevan el uso de estas técnicas son, por lo general, el daño estructural al material, debido a los procesos a los que debe someterse. BIBLIOGRAFÍA

[1] San Juán, Carlos (2018). La microscopía electrónica de barrido SEM. [online] Disponible en https://www.patologiasconstruccion.net/2012/12/lamicroscopia-electronica-de-barrido-sem-i-concepto-yusos/ [2] Universitat Politècnica de València. Preparación de muestras para el microscopio de barrido. [online] Disponible en http://www.upv.es/entidades/SME/info/753330normalc.h tml

[3] Silva, Héctor (2017). Microscopios Electrónicos de Transmisión (TEM). [online] Disponible en http://www.linan-ipicyt.mx/Microscopio_HR-TEM.html [4] Universitat Politècnica de València (2017). Preparación de muestras para el microscopio de transmisión. [online] Disponible en http://www.upv.es/entidades/SME/info/753331normalc.h tmlhttp://www.upv.es/entidades/SME/info/753331normal c.html [5] Sundaram (2019). Preparación de la muestra en TEM. [online] Disponible en https://www.newsmedical.net/life-sciences/Sample-Preparation-in-TEM(Spanish).aspx [6] Universidad Autónoma de Puebla (2011). Crecimiento en fluido fisiológico simulado de hidroxiapatita sobre películas de PMMA sílice-CaO. [online] Disponible en http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S166535212011000300004&script=sci_arttext&tlng=en [7] Aguiar, Serra y González. Los vidrios bioactivos en el mundo de los biomateriales. [online] Disponible en DialNet...