Mikroskopia elektronowa i skaningowa (TEM oraz SEM). PDF

Preview

Summary

Wykładowca: dr hab. Małgorzata Kozieradzka-Kiszkurno, prof, UG (Katedra Cytologii i Embriologii Roślin). Punkty ECTS: 3. Spis treści: Wprowadzenie do mikroskopii elektronowej. Przygotowanie materiału i jego badanie w transmisyjnym mikroskopie elektronowym. Mikroskopia skaningowa. ...

Description

Nowoczesne techniki badawcze w biologii i medycynie Wykład 2. Mikroskopia elektronowa i skaningowa. 1. Wprowadzenie do mikroskopii elektronowej. Mikroskopy elektronowe – rodzaj mikroskopów wykorzystywanych do wytworzenia obrazu powiększonego od 1000 do 500,000x przy użyciu strumieniu elektronów (e-) wytwarzanego w warunkach wysokiej próżni. Mikroskopia elektronowa umożliwia pomiary rzędu nanometrów (mikroskopia świetlna – mikrometrów). W zależności od sposobu wykorzystania wiązki elektronów mikroskopy elektronowe dzielimy na: • transmisyjne (transmisyjny mikroskop elektronowy, TEM, ang. transmission electron microscope) – wiązka elektronów przenika przez preparat dając jego obraz na fluoryzującym ekranie lub materiale fotograficznym. Mikroskopy te w zależności od wielkości napięcia przyspieszającego ruch elektronów dzielimy na nisko- (50-200kV), wysoko- (1000kV) i superwysokonapięciowe (5000kV); • emisyjne (skaningowy mikroskop elektronowy, SEM, ang. scanning electron microscope) – obraz tworzy wtórna wiązka elektronów emitowana przez sam preparat; • odbiciowe – obraz tworzony jest na podstawie pierwotnej wiązki elektronów odbitej z preparatu. Oryginalny obraz uzyskiwany w mikroskopach elektronowych widziany jest w kolorach czerni, bieli oraz odcieniach szarości: • obszary lub struktury w jasnych odcieniach nazywane są strukturami transparentnymi lub przezroczystymi; • obszary lub struktury w ciemnych odcieniach nazywane są strukturami elektronowogęstymi. Pierwszy mikroskop elektronowy został zbudowany w 1931 roku przez M. Knolla i R. Ruska według idei mikroskopu optycznego. Uzyskane po raz pierwszy w tego typu mikroskopie historyczne zdjęcie pojedynczej komórki charakteryzowało się bardzo niską jakością i małą możliwością identyfikacji poszczególnych organelli komórkowych.

Rysunek 1. Pierwsze, historyczne zdjęcie komórki fibroblastu kurczaka spod mikroskopu elektronowego.

2. Przygotowanie materiału i jego badanie w transmisyjnym mikroskopie elektronowym. pobieranie materiału → utrwalanie → odwadnianie → przesycanie żywicą → zatapianie w żywicy → krojenie ultracienkich skrawków → montowanie skrawków na siatki → kontrastowanie → krojenie ultracienkich skrawków → oglądanie preparatów w mikroskopie elektronowym •

utrwalanie – można wykorzystać tutaj dwie techniki: o chemiczną – wykorzystującą chemiczne właściwości tzw. utrwalaczy, które wiążą molekuły komórkowe szybko i stabilnie, umożliwiając zatrzymanie komórki lub tkanki w czasie np.:

§

czterotlenek osmu (OsO4) – jest jednocześnie utrwalaczem i barwnikiem. Utrwala tkankę wiążąc się z lipidami, zaś jako metal ciężki kontrastuje błony biologiczne zarówno komórkowe jak i organelli wewnątrzkomórkowych; § sole nadmanganianu – rzadko stosowane ze względu na ich negatywny wpływ na nielipidowe składniki komórkowe (białka cytoplazmatyczne, rybosomy, elementy cytoszkieletu); o fizyczną – wykonywaną w bardzo niskich temperaturach. Proces musi być bardzo szybki, ponieważ tylko w takich warunkach woda obecna w komórce nie tworzy kryształów lodu, które mogłyby rozerwać struktury komórkowe: § ciekły azot (LN2) – azot pierwiastkowy w stanie ciekłym mającym temperaturę około -195°C; • przesycanie żywicą – do czego wykorzystuje się żywice epoksydowe i akrylowe; • kontrastowanie – wykonywane solami ołowiu, uranu oraz nadmanganianu; • krojenie ultracienkich skrawków (trymowanie bloczków) – wykonywane po zanurzeniu danego preparatu w bloku żywicy, który następnie zostaje przygotowany do krojenia przez trymowanie, po czym zostają wykonywane właściwe preparaty przy użyciu specjalnego noża wykonanego z syntetycznego diamentu. Od grubości skrawków zależy ich barwa interferencyjna; • oglądanie preparatów w mikroskopie elektronowym – jest możliwe dzięki ich umieszczeniu na specjalnych siatkach, które mogą różnić się wielkością oczek. Pod wpływem wiązki elektronów fluorescencyjna substancja wysycająca ekran emituje światło widzialne. Na ekranie, który znajduje się u podstawy kolumny tworzy się dostrzegalny obraz. W mikroskopach elektronowych wykorzystywane są katody i anody. Katodę stanowi drucik wolframowy, który rozżarzony do temperatury 2300°C emituje elektrony. Na drodze do anody elektrony przyspieszane są do ½ prędkości światła, a następnie ulegają skupieniu przez soczewkę kondensatora na badanym preparacie. Tu zderzają się one z atomami preparatu i są rozpraszane lub pochłaniane proporcjonalnie do grubości preparatu i stopnia jego skondensowania. Następnie wiązka zostaje odchylona w soczewce obiektywu i powstaje powiększony, pośredni obraz przedmiotu. Ponownie jest on powiększany przez soczewkę projektora i pada na ekran fluoryzujący dający obraz widzialny dla oka. Zdolność rozdzielcza mikroskopu elektronowego, tak jak i świetlnego, jest wprost proporcjonalna do wielkości apertury i odwrotnie proporcjonalna do długości fali.

Rysunek 2. Schemat działania transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Przygotowanie transmisyjnego mikroskopu elektronowego do pracy polega na: • wytworzeniu wysokiej próżni; • regulacji wysokiego napięcia; • regulacji prądu grzania filamentu wolframowego; • centrowaniu filametu; • centrowaniu przesłon kondensora i obiektywów; • regulacji parametrów optycznych soczewki obiektywowej; • włączaniu systemu rejestracji fotograficznej. Natomiast praca z TEM wymaga stałej regulacji: • jaskrawości obrazu; • powiększenia; • ostrości. W trakcie pracy z transmisyjnym mikroskopem elektronowym wykonuje się elektronogramy (mikrografie elektronowe), czyli zdjęcia spod mikroskopów elektronowych stanowiących dokumentację badań.

Rysunek 3. i 4. Przykładowe elektronogramy struktur komórkowych.

W badaniach immunohistochemicznych na poziomie mikroskopu elektronowego stosuje się przeciwciała znakowane koloidalnym złotem o średnicy od 5 do 40 nm. Ziarenka metalicznego złota są widoczne w postaci kontrastowych punktów, wyraźnie lokalizujących miejsce związania przeciwciała z tkanką.

Rysunek 5. Elektronogram z widocznymi punktami wyznakowanymi koloidalnym złotem.

Potężny analityczny mikroskop elektronowy Titan Cubed G-2 60-300 – przykład mikroskopu elektronowego, urządzenie najnowszej generacji, określane jako „supermikroskop” na Wydziale Inżynierii Metali i Informatyki Przemysłowej AGH w Krakowie, którego wyniki pracy, czyli badania mikrostruktury oraz określania składu chemicznego w skali mikro-, nano- i w skali atomowej będą wykorzystywane w interdyscyplinarnych dziedzinach: inżynierii materiałowej, fizyki, chemii, biologii, medycynie. Wysokonapięciowy mikroskop elektronowy (HVEM) – odmiana mikroskopu elektronowego charakteryzująca się napięciem przyspieszającym strumień elektronów (1-3 MV), który może przechodzić przez wielokrotnie grubsze powłoki w stosunku do zwykłego mikroskopu elektronowego. 3. Mikroskopia skaningowa. Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM) – służy on do badania zróżnicowanych przestrzennie powierzchni próbek i pozwala na uzyskanie ich plastycznego, nieomal trójwymiarowego obrazu o znacznej głębi ostrości (3D). W mikroskopie tym strumień elektronów skupiany jest przez kondensor i obiektyw tak, że punktowa wiązka elektronów pada na powierzchnię pokrytą warstewką metalu (np. złotem lub platyną), która nie przepuszcza elektronów. Pomiędzy soczewką obiektywową a próbką zamontowany jest układ elektromagnetyczny tzw. deflektor stale zmieniający kierunek biegu wiązki. Elektrony zostają wtórnie i wstecznie rozproszone i wychwytywane są przez detektor (złożony ze scyntylatora, fotokatody, fotopowielacza), które przetwarzają energię elektronów na impulsy świetlne, a następnie elektryczne.

Rysunek 6. i 7. Schemat działania skaningowego mikroskopu elektronowego oraz preparat przygotowany do badań poprzez pokrycie go cienką warstwą złota.

Skaningowy mikroskop elektronowy w stosuje się w badaniach biologicznych: • obiektów twardych, np.: skrzydeł motyli, ziaren pyłku, zarodników, komórek glonów; • tkanek miękkich, np.: wierzchołków wzrostu pędu z zawiązkami liści o różnych układach przestrzennych; • z zakresu parazytologii, np.: podczas śledzenia procesu infekcji i wzajemnej relacji pasożyt-żywiciel; • do identyfikacji i badania komórek nowotworowych czy powierzchni izolowanych protoplastów z poszczególnymi etapami regeneracji ściany komórkowej. Skaningowy mikroskop tunelowy (STM, ang. scanning tunneling microscope) – rodzaj SPM, mikroskopu ze skanującą sondą (ang. scanning probe microscope), który umożliwia uzyskanie obrazu powierzchni materiałów przewodzących ze zdolnością rozdzielczą rzędu pojedynczego atomu. Uzyskanie obrazu powierzchni jest możliwe dzięki wykorzystaniu zjawiska tunelowego, od którego przyrząd ten wziął swoją nazwę. Ten sam skrót używany jest do określenia gałęzi mikroskopii STM (ang. scanning tunneling microscopy). Mikroskop ten

działa w oparciu o efekt tunelowy. Ostrze i próbkę zbliża się na odległość ok. 1 nm. Następnie przykłada się różnicę potencjałów U rzędu 1-3 V, która powoduje powstanie różnicy w poziomach ostrza i próbki, dostarczając tym samym wolnych stanów po stronie ostrza. Przemieszczając ostrze ponad badaną powierzchnią, system rejestruje zmiany prądu tunelowego IT w funkcji odległości ostrze-próbka tworząc zbiór danych, który po odpowiednich przeliczeniach daje obraz próbki.

Rysunek 8. i 9. Schematy działania skaningowego mikroskopu tunelowego.

Skaningową mikroskopię tunelową wykorzystuje się w obrazowaniu struktury atomowej i profilu powierzchni skanowanej próbki. Mikroskop STM stał się pierwszym prawdziwym narzędziem nanotechnologii 1. Uzyskując zależność prądu tunelowego od napięcia polaryzacji ostrze-próbka można wiele powiedzieć o lokalnych własnościach elektronowych powierzchni próbki, przykładowo można wyznaczyć lokalną gęstość stanów. STM pomaga zrozumieć wiele zjawisk powierzchniowych takich jak adhezja, kohezja, tarcie i wiele innych zjawisk biologicznych.

Rysunek 10. i 11. Obraz powierzchni krzemu (Si) o wielkości 10x10 nm oraz obraz złota (Au) znajdującego się na powierzchni krzemu o wymiarach 100x100 nm spod skaningowego mikroskopu tunelowego.

technologia, gdzie kluczową rolę odgrywają wymiary lub tolerancje wymiarów, które podawane są w zakresie 0,1 – 100 nm (od rozmiarów atomowych porównywalnych z długością światła widzialnego).

1...